Citazione:

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Messaggio inserito da chick80

Ti rispondo io TMax, è il primo caso. Praticamente si prende una piccola aliquota di cellule e si conta quell'aliquota usando una cameretta per conte. Dopodichè quelle cellule si buttano via (ovviamente il numero di cellule che prendi è trascurabile rispetto al totale).

Comunque, se ci scordiamo un attimo della piastra, ecco quello che si può fare in R. kristanko, se non sai usare R (che puoi scaricare gratuitamente da www.r-project.org ) il codice ti sembrerà abbastanza incomprensibile. Ho cercato di commentarlo il più possibile.

Allego il file csv con i dati riorganizzati (c'è dentro anche la piastra ma non la uso nei calcoli qui sotto).

# Leggiamo il file csv
counts <- read.table("conte.csv", header=TRUE, sep=",")
# Riordiniamo i livelli della colonna gruppo e marchiamo la piastra come fattore
counts$Gruppo <- factor(counts$Gruppo, levels=c("CTRL", "C1", "C5"))

# Ora possiamo chiamare la funzione aov che effettua un'analisi della varianza su di un modello lineare. 
#Questo è equivalente a generare un modello lineare con la funzione lm e poi lanciare la funzione anova sul risultato.
# La formula Cellule ~ Gruppo * Tempo sta ad indicare che vogliamo vedere la variazione
# di cellule in relazione al Gruppo ed al tempo. Usiamo il '*' tra i due fattori perchè 
# ci interessa l'interazione fra i due; in caso contrario avremmo usato +.
counts.aov <- aov(Cellule ~ Gruppo * Tempo, data = counts)
# Scriviamo il risultato
print(summary(counts.aov))

Otteniamo come risultato

             Df     Sum Sq    Mean Sq  F value    Pr(>F)    
Gruppo        2 2.1517e+10 1.0758e+10   9.3834 0.0008053 ***
Tempo         2 3.1434e+11 1.5717e+11 137.0824 7.237e-15 ***
Gruppo:Tempo  4 4.3083e+09 1.0771e+09   0.9394 0.4562086    
Residuals    27 3.0956e+10 1.1465e+09                       
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Signif. codes:  0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 

La tabella ci dà diverse informazioni come i gradi di libertà (Df), la somma dei quadrati dei residui (Sum Sq) la statistica F e il tanto desiderato p-value!

Come vedi c'è sia un effetto del tempo che del trattamento ma non un effetto "incrociato" dei due fattori.

Volendo però vedere quali tempi e quali gruppi sono diversi fra di loro, dobbiamo fare un test post-hoc, in cui confrontiamo tutte le misurazioni fra loro.

Lanciamo

# Scriviamo l'output del test di Tukey
print(TukeyHSD(counts.aov))

Che ci dà

  Tukey multiple comparisons of means
    95% family-wise confidence level

Fit: aov(formula = Cellule ~ Gruppo * Tempo, data = counts)

$Gruppo
              diff       lwr       upr     p adj
C1-CTRL -55833.333 -90107.46 -21559.21 0.0011264
C5-CTRL -46666.667 -80940.79 -12392.54 0.0061491
C5-C1     9166.667 -25107.46  43440.79 0.7865850

$Tempo
          diff       lwr      upr p adj
48h-24h 107500  73225.88 141774.1 1e-07
72h-24h 228750 194475.88 263024.1 0e+00
72h-48h 121250  86975.88 155524.1 0e+00

$`Gruppo:Tempo`
                    diff         lwr         upr     p adj
C1:24h-CTRL:24h   -32500 -113060.708  48060.7078 0.9038497
C5:24h-CTRL:24h   -30000 -110560.708  50560.7078 0.9363135
CTRL:48h-CTRL:24h 116250   35689.292 196810.7078 0.0012823
C1:48h-CTRL:24h    57500  -23060.708 138060.7078 0.3227981
[output tagliato]

Come vedi sia C1 che C5 sono diversi (p<0.05) dai controlli, ma non fra di loro. I tre tempi sono tutti diversi fra loro (non una grande sorpresa qui).

Ho tagliato l'output dei confronti incrociati perchè non dava informazioni ulteriori (avevamo già visto dalla chiamata ad AOV che non c'erano interazioni significative).
Se guardi giusto l'inizio, infatti, sono diversi fra loro solo i casi in cui uno dei fattori è fisso e l'altro varia, ma non situazioni in cui i 2 fattori sono diversi in entrambi i termini.

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E se volessimo considerare le piastre? R ci permette di fare un modello ad effetti misti.
Il problema qui è che credo ci sia un artefatto dovuto al fatto che il fattore Piastre è uguale al fattore Gruppo e quindi anova non riesce a calcolarmi un p-value per il fattore Gruppo.
Se bariamo e facciamo finta che i 4 replicati vengano da 2 piastre diverse allora il tutto funziona ed otteniamo un output simile a quello di cui sopra (se qualcuno fosse interessato posso postare il codice).

OVVIAMENTE QUESTO LO FACCIO SOLO PER SCOPO DIMOSTRATIVO. SE VUOI CONSIDERARE L'EFFETTO DELLA PIASTRA DEVI RIFARE L'ESPERIMENTO CON ALTRE PIASTRE, COME HA DETTO TMax.

GRUPPI

               Estimate Std. Error z value Pr(>|z|)   
C1 - CTRL == 0   -55833      18742  -2.979  0.00812 **
C5 - CTRL == 0   -46667      18742  -2.490  0.03416 * 
C5 - C1 == 0       9167      18742   0.489  0.87650   

TEMPI

Linear Hypotheses:
               Estimate Std. Error z value Pr(>|z|)    
48h - 24h == 0   107500      13125   8.190   <1e-10 ***
72h - 24h == 0   228750      13125  17.428   <1e-10 ***
72h - 48h == 0   121250      13125   9.238   <1e-10 ***

Allegato: conte.csv.zip
1,16 KB

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Citazione:

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La terza cosa (più importante): è un effetto biologicamente rilevante quello che osserviamo? Alla fine è quello che ci interessa!

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Citazione:

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la prima è se dobbiamo o no considerare l'interazione tempo*trattamento come la vera variabile di interesse.
In questo caso forse no, perchè possiamo (ma dipende fortemente da ragioni biologiche) ritenere che già a 24 ore sussistesse una differenza nella crescita cellulare e che questa differenza sia rimasta circa dello stesso ordine negli altri tempi. Sarebbe diverso se avessimo effettuato una misurazione al tempo 0: a quel punto ci saremmo dovuti aspettare che le rette (spezzate) di regressione divergessero.

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Citazione:

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guarda poi
plot(resid(counts.aov)~counts$Tempo)
(allegato)
se utilizzassi la trasformazione logaritmica: prova
require(MASS)
boxcox(counts.aov)
anche il modello avrebbe un altra interpretazione per quel che riguarda la additività (non interazione)

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Citazione:

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Messaggio inserito da chick80


In sostanza comunque credo che sia una buona pista da seguire se l'inibizione della crescita è quello che ti interessa, quindi vale la pena di ripetere l'esperimento e poi analizzarlo come sopra (con il modello a effetti misti).

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Citazione:

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Ho piastrato le mie cellule. Le ho piastrate in 20 Fiasche Piccole ad una concentrazione molto inferiore a quella che di confluenza per queste cellule, nel caso specifico circa 50000 cellule per fiasca.

e adesso

[quote]Messaggio inserito da kristanko

INNANZITUTTO grazie a tutti per aver perso tempo sui miei dati..

Chick e Tmax, non sar� stato chiaro io, per� :

tempo 0 -> piastro le cellule e ne metto circa la stessa quantit� nelle piastre.
dopo 24 ore -> conto le cellule e applico il trattamento
ogni 24 ore -> conto le cellule

� ESATTAMENTE quello che ho fatto.

"Fattore Piastra" tanto discusso. Come ho gi� spiegato sono DIECI fiasche diverse. Non la stessa che entrava e usciva dall'incubatore. La fiasca su cui venivano fatte le conte dopo veniva buttata. Parto dal presupposto che le fiasche presenti nell'incubatore siano tutte uguali tra di loro e indipendenti. No? Certo ci possono essere problemi di "posizione nell'incubatore" o non so cos'altro. Ma avendo posto le fiasche tutte nello stesso incubatore, nello stesso tempo, nello stesso ripiano dell'incubatore posso presupporre che un eventuale errore presente nel fattore "fiasca/piastra" sia distribuito egualmente in tutte le fiasche di cellule trattate e non?
E che quindi se ho una differenza fra trattato e non trattato questa dipenda per lo pi� al trattamento medesimo?

Ditemi voi come avreste improntato il disegno sperimentale per non cadere nel problema delle piastre a questo punto.

CREDO, ma vado per supposizione, che ci� che mi interessasse maggiormente � che "la differenza fra CNTR e trattati NON SIA imputabile al caso". Se questa DIFFERENZA � significativa non vedo altri errori.

Ho dieci fiasche uguali e indipendenti dentro cui le cellule crescono partendo da un numero iniziale che � stato prima "calcolato" e poi verificato tramite conte dopo 24 ore dalla piastratura. A questo punto ho trattato le cellule e ne ho lasciate crescere altre senza trattamento MA TUTTE NELLE STESSE IDENTICHE CONDIZIONI. A time point ben precisi di 24 ore le ho contate. Una fiasca per ogni trattamento e una per il controllo. Le fiasche venivano quindi non pi� considerate. Le cellule che intanto crescevano nelle altre fiasche non si muovevano dall'incubatore per nessun motivo! Sempre cellule di CNTR rispetto a cellule TRATTATE.
Alla fine, raccogliendo i dati ho 3 curve "n' di cellule/ tempo". Una curva per il CNTR e una per ogni trattato.

TMax, non so se questi dati meritino di essere pubblicati o no, certo non sono Soldi Buttati o esprimono "esperimenti fatti senza disegno sperimentale". Sinceramente non vedo altro modo per svolgere questo tipo di sperimentazione dovendosi basare su delle conte cellulari. Anzi!! Io per primo esprimo seri dubbi sulla VALIDITA' delle conte svolte in questo modo con una cameretta di Burker e cos� via... La risposta che mi � stata data non � mai stata "SI questo metodo funziona" .. M A I!! Mi � sempre stato detto "Si questo metodo � ACCETTATO nelle pubblicazioni" che a mio avviso � una cosa molto molto differente. In altre parole tutto il mondo � paese.

Accetto consigli su come sarebbe pi� corretto impostare l'esperimento!
La notizia migliore � che inizio a capire quello che scrivete! ;)

Grazie a tutti.

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Citazione:

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Chick e Tmax, non sarò stato chiaro io, però :

tempo 0 -> piastro le cellule e ne metto circa la stessa quantità nelle piastre.
dopo 24 ore -> conto le cellule e applico il trattamento
ogni 24 ore -> conto le cellule

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Citazione:

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"Fattore Piastra" tanto discusso. Come ho già spiegato sono DIECI fiasche diverse. Non la stessa che entrava e usciva dall'incubatore. La fiasca su cui venivano fatte le conte dopo veniva buttata. Parto dal presupposto che le fiasche presenti nell'incubatore siano tutte uguali tra di loro e indipendenti. No? Certo ci possono essere problemi di "posizione nell'incubatore" o non so cos'altro. Ma avendo posto le fiasche tutte nello stesso incubatore, nello stesso tempo, nello stesso ripiano dell'incubatore posso presupporre che un eventuale errore presente nel fattore "fiasca/piastra" sia distribuito egualmente in tutte le fiasche di cellule trattate e non?
E che quindi se ho una differenza fra trattato e non trattato questa dipenda per lo più al trattamento medesimo?

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Citazione:

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Ditemi voi come avreste improntato il disegno sperimentale per non cadere nel problema delle piastre a questo punto.

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Citazione:

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La risposta che mi è stata data non è mai stata "SI questo metodo funziona" .. M A I!! Mi è sempre stato detto "Si questo metodo è ACCETTATO nelle pubblicazioni" che a mio avviso è una cosa molto molto differente. In altre parole tutto il mondo è paese.

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Citazione:

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Per il resto mi sa che ci ritroviamo finally no? :)

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Citazione:

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ah.. e torno a dire che il fatto di NON considerare il tempo t0 come normalizzatore di tutti gli altri dati, è dovuto alla semplice costatazione che ho piastrato lo stesso numero di cellule IN TUTTE E DIECI LE FIASCHE. Al tempo t0 le tre curve passerebbero tutte e tre dallo stesso punto. In altri termini dovrei normalizzare tutti i dati rispetto ad uno stesso e unico dato. Dividere tutti i numeri per lo stesso numero, non cambierebbe le differenze fra i dati.

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