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tato
Nuovo Arrivato
Prov.: Catanzaro
Città: catanzaro
16 Messaggi |
 Inserito il - 15 giugno 2006 : 08:20:05
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Colleghi Biotecnologi, buon giorno.
Tra di voi c'è qualcuno che può inserire, online, i protocolli per disegnare i primers?
 Non conoscendo la procedura, sto impazzendo nella ricerca dei primers per TRK-A, p75 ed NGFR.
Volete darmi una mano?
Grazie 1000!!!!!!!!!!!!!!!!
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 16 giugno 2006 : 02:20:45
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Allora, in generale non è una cosa che si fa in cinque minuti se la vuoi fare bene... ti dico il mio approccio, poi ovviamente ognuno ha il suo metodo! Per fare un esempio prendiamo il gene TRK-A.
Suppongo tu voglia fare solo RT-PCR qualitativa (il gene c'è oppure non c'è), per PCR preparativa/real time l'approccio è lievemente differente.
1) Leggersi la letteratura a riguardo (salterò questo step ...  )
2) Il gene per TRKA (tyrosine kinase receptor A) è chiamato NTRK1, come puoi vedere su Entrez Gene.
3) Cliccando sul link nella pagina linkata sopra arrivi qui dove trovi un sacco di info sul gene.
4) Andando su Entrez Nucleotide puoi cercare NTRK1 e trovi un sacco di entries.
5) Ora, non ho idea in che specie ti serva, nell'uomo ci sono molte varianti di splicing, quindi devi prendere quella che ti interessa, per semplicità prendo quella di ratto, che sembra non avere varianti di splicing. (NM_021589)
Nota che questo è l'mRNA
6) Ora, se guardi le "features" vedrai che il gene è di 2633 bp (gene 1..2633), e la coding sequence è 62..2461
In generale io prenderei una sequenza che cada nella CDS, anche perchè è meglio evitare di andare ad amplificare le estremità.
7) In alto scegli: display->FASTA e otterrai solo la sequenza di nucleotidi
8) Vai su Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/)
e incolla la sequenza in FASTA. In alto puoi selezionare RODENT come mispriming library, e controlla che siano selezionati "pick left primer" e "pick right primer" (non ti serve la probe).
9) puoi fare direttamente Pick Primers per vedere cosa ottieni, oppure settare un po' i parametri. Ad es. primer size, che di default è 18-27, con un ottimale di 20, la Tm (57-63, opt 60) e cosi' via. In generale i parametri di default vanno bene.
Leggi http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www_help.cgi per avere più info sui vari parametri.
10) Una volta fatto Pick Primers ti darà una scelta principale
LEFT PRIMER GTCTGGTGGGTCAGGGACTA
RIGHT PRIMER GGGTTGCTTTCCATAGGTGA
e sotto altre scelte alternative
Quella principale non sembra male (Tm dei due primer molto vicine e attorno a 60, 50-60% GC, amplificato di 215 bp).
11) Vai su NCBI BLAST e inserisci la sequenza dei primers (uno alla volta)
Come database puoi usare nr (non redundant) oppure scegliere est human, est mouse etc. a seconda del gene che stai guardando (non c'è rat, quindi usiamo nr).
Nelle opzioni usa come limiti Rattus Norvegicus, metti la word size a 7 e expect value a 1000, come suggerito qui.
12) Premi Blast! e poi Format
13) La scelta non è il massimo, visto che ci sono molti match con altri geni per entrambi i primers, anche se a prima vista sembra che i geni "estranei" siano diversi.
Ad ogni modo io a questo punto proverei con altri primers da primer3.
Se la fortuna non ti assiste potresti cominciare a fare uno studio più approfondito sulla proteina: trova quali sono i domini tipici della proteina, e cerca di fare primers in quella regione. |
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Saretta
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Provincia di Roma
263 Messaggi |
Inserito il - 17 giugno 2006 : 13:05:03
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| Una domanda generica: Io devo fare una PCR ad un frammento di DNA. A livello teorico devo progettare i due primer al 5' e al 3' semplicemente complementari? Senza altre aggiunte? Esempio: sequenza -AATGGCTTAGCCAT-, quali sarebbero i due primer? |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2006 : 10:08:26
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Citazione:
Messaggio inserito da chick80
[...cut...]
questa e' una buona risposta, varrebbe la pena di ricopiarla nel wiki.
Citazione:
Una domanda generica: Io devo fare una PCR ad un frammento di DNA. A livello teorico devo progettare i due primer al 5' e al 3' semplicemente complementari? Senza altre aggiunte? Esempio: sequenza -AATGGCTTAGCCAT-, quali sarebbero i due primer?
aspetta, questa seq. mi sembra troppo corta per calcolare dei primer. |
Il mio blog di bioinformatics (inglese): BioinfoBlog
Sono un po' lento a rispondere, posso tardare anche qualche giorno... ma abbiate fede! :-) |
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Saretta
Utente Junior
Prov.: Roma
Città: Provincia di Roma
263 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2006 : 13:24:46
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Si perdonami, avevo un vuoto su alcuni esercizi sulla PCR ma credo di averlo colmanto, è sufficiente progettare primers di circa 15-20 nucleotidi complementari alle due estremità..almeno credo! |
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2006 : 17:27:51
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Non complementari!
Quando li ordini il forward deve essere UGUALE alla sequenza, il reverse REVERSE COMPLEMENTARE!
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Petemme
Nuovo Arrivato
93 Messaggi |
Inserito il - 19 giugno 2006 : 20:04:09
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Grande! Oggi ho usato la tecnica descritta da chick80 per la prima volta  |
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dallolio_gm
Moderatore
Prov.: Bo!
Città: Barcelona/Bologna
2445 Messaggi |
Inserito il - 01 maggio 2008 : 10:24:23
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Recentemente é stato postato un link al programma perlprimer (grazie all'utente dr. zoidberg).
Lo si può scaricare dall'indirizzo:
- http://perlprimer.sourceforge.net/
Mi sembra essere realizzato piuttosto bene, anche se la grafica é un po' antiquata.
E' multipiattaforma e gli utenti Debian/Ubuntu lo possono installare facilmente dai repository ufficiali, senza dover scaricare dal sito. |
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dr zoidberg
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 29 maggio 2008 : 14:14:05
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ringraziate linux ubuntu e tutti i software open source
io l'ho trovato grazie alla lista programmi di ubuntu... |
«Vivi come se dovessi morire domani. Impara come se dovessi vivere per sempre.»
Gandhi |
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leptingo
Nuovo Arrivato
Prov.: Caserta
Città: SAN MARCO EV.
1 Messaggi |
Inserito il - 31 maggio 2008 : 13:07:58
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 salve a tutti. Io ho scaricato il programma per la ricerca dei primers "perlprimer" per la ricerca di un primer di circa 336 bp della regione 5' UTR dell'HCV ma ho difficoltà nell'ottenere un primer che mi copra l'intera regione di 341bp. infatti l'amplificato più lungo che mi da è di 277 bp. come faccio a far capire al programma che come range di amplificazione voglio tutta la regione? oppure sapete suggerirmi qualche altro programma che mi permette di ottenere quello che cerco? grazie infinite!!!!! kiss |
KATIA |
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dr zoidberg
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 05 giugno 2008 : 18:20:50
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io in genere lo uso per primer in real time in questa funzione si può scegliere la lunghezza dell'amplificato puoi provare modificando i dati lì e vedere che cosa ne esce...
ciao
in bocca al lupo |
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Gandhi |
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francavilla
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 28 luglio 2008 : 14:45:04
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grazie mille del consiglio, mi é stato molto utile |
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domi84
Moderatore
Città: Glasgow
1724 Messaggi |
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kia35
Nuovo Arrivato
Prov.: Varese
Città: Barasso
15 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2009 : 15:41:27
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Ciao! io avrei il problema opposto..ho dei primer per il cDNA gia disegnati (li ho trovati in lab quindi so solo la sequenza) e vorrei sapere in quale regione della mia sequenza codificante cadono..ci sono dei programmi che mi possono aiutare?
Grazie 1000! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 22 marzo 2009 : 16:08:25
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Citazione:
Messaggio inserito da kia35
Ciao! io avrei il problema opposto..ho dei primer per il cDNA gia disegnati (li ho trovati in lab quindi so solo la sequenza) e vorrei sapere in quale regione della mia sequenza codificante cadono..ci sono dei programmi che mi possono aiutare?
Grazie 1000!
per quello guarda questa discussione: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=12402
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Laracroftit
Nuovo Arrivato
Città: Sassari
37 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2009 : 11:35:35
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Citazione:
Recentemente é stato postato un link al programma perlprimer (grazie all'utente dr. zoidberg).
Lo si può scaricare dall'indirizzo:
- http://perlprimer.sourceforge.net/
Mi sembra essere realizzato piuttosto bene, anche se la grafica é un po' antiquata.
E' multipiattaforma e gli utenti Debian/Ubuntu lo possono installare facilmente dai repository ufficiali, senza dover scaricare dal sito.
Ciao a tutti!
volevo sapere se il programma consigliato da dallolio va bene anche per disegnare primers per la rea-time PCR. E nel caso avete qualche programma da consigliarmi?magari uno semplice, poichè è la prima volta che disegno primers, ma affidabile!
Grazie mille!
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"I want to know God's thoughts...
...the rest are details."
(Albert Einstein) |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2009 : 12:44:48
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Beh secondo me da quando hanno fatto Primer Blast, gli altri programmi sono meno utilizzati.
In ogni caso ti consiglio di utilizzarlo per controllare che siano specifici per la tua sequenza.
Se devi disegnare primer per real-time esistono anche delle banche dati che contengono primer già testati e validati per real-time, da qualche parte c'è una discussione con i link.
(piccolo consiglio personale, anche se li scegli dalla banca dati CONTROLLALI!!! una volta mi hanno fatto un brutto scherzo queste banche dati)
In ogni caso non ci sono grosse differenze tra il disegno dei primers per real-time o PCR end point, a parte il fatto che i frammenti amplificati devono essere abbastanza corti, e ovviamente è importante che verifichi che i tuoi primers non facciano dimeri.
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sr
Nuovo Arrivato
1 Messaggi |
Inserito il - 13 aprile 2009 : 20:38:57
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salve ragazzi
spero che qualcuno possa aiutarmi!Ho un problema con Perlprimer, il software che molti di voi conosceranno per disegnare primers.Io purtroppo lo conosco da poco e non ne sono molto pratico.Comunque il mio problema è che non riesco ad importare in nessun modo la mia sequenza(oltre 1300bp) su cui dovrò fare i miei primer, prima di tutto perchè non mi importa il file fasta salvato come file di txt e provando a scaricarla con ensembl non riesce ad attacarsi al server e mi restituisce errore. Qualcuno ha un'idea su come possa risolvere questa cosa ed evitarmi di impazzire a scrivere le ATGCTAGCTA.....
vi ringrazio
ciao |
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eleanor
Nuovo Arrivato
26 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2010 : 17:22:35
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Salve ragazzi, mi sto cimentando per la prima volta nel disegnare dei primers per amplificazione di geni del virus Grapevine fan leaf virus. Prima però devo trovare su GenBank sequenze di questo virus e poi le sequenze più conservate e disegnare dei primers su di esse.
Qualcuno sa come si fa?
Grazie mille |
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Vanilla Sky
Utente Junior
204 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2010 : 19:40:07
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Ciao, dunque per trovare le sequenze che cerchi devi andare sul sito di PubMed: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/
Troverai in alto a sinistra "Search" con accanto una tendina in cui dovrai selezionare "Nucleotide".
A questo punto digita nello spazio sotto "Grapevine fanleaf virus".
(Premetto che sono ignorante in ambito agrario, ma ho visto che in questo modo ti vengono fuori 385 risultati, davvero tanti!!Sai se ti devi concentrare su un gene specifico?Perchè ho visto che in alto PubMed riporta): Citazione:
This search in Gene shows 3 results, including:
GFLVs1gp1 (Grapevine fanleaf virus): 253K polyprotein
GFLVs2gp1 (Grapevine fanleaf virus): polyprotein
GfvsRgp1 (Grapevine fanleaf virus satellite RNA): 39K product, P3
Per salvarti la sequenza nucleotidica di ogni risultato che ti si propone, clicca il nome della sequenza (che è sottolineata ed evidenziata in blu): si caricherà una finestra che include la notazione della sequenza. In alto a destra clicca su "Download" e seleziona "FASTA", in questo modo ti potrai salvare solamente la sequenza nucleotidica.
Dopo aver eseguito questo procedimento per tutte le sequenze che ti interessano, dovrai allinearti le sequenze per vedere le regioni conservate sulle quali disegnarti i primer.
So che solitamente si usa BioEdit (è un programma gratuito che si può scaricare).
A questo punto non so come funzioni esattamente,perchè avendo un macintosh uso un altro programma..sorry!
Per disegnare i primer basta guardare le precedenti discussioni.
Spero di esserti stata un pò d'aiuto!
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eleanor
Nuovo Arrivato
26 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2010 : 22:00:05
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Grazie......almeno ora so come procedere! Hai ragione i risultati sono tanti e purtroppo non so ancora su quale gene concentrarmi (di regola dovrei capire io quale gene considerare) ma domani chiederò meglio al prof!!
Se sono ancora in crisi mi farò viva!!! |
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SELE480840
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 07 giugno 2010 : 12:38:46
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| ciao ragazzi...è la prima volta che scrivo...e sinceramente nn so se qst msg arriverà -.-' vorrei porvi un quesito....se io volessi mutare un aa in una sequenza proteica come faccio a disegnare un primer che rechi l'alterazione nucleotidica desiderata nella sequenza genica'??? grazie |
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Giulietta_BCM
Nuovo Arrivato
6 Messaggi |
Inserito il - 20 agosto 2010 : 11:16:27
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| Salve a tutti !! sto lavorando con il gene DEK-CAN e vorrei fare una long range PCR ma sto impazzendo con la ricerca dei primers! i programmi che avete citato sopra come Primer blast o perlprimer sono adatti anche per la long o ci sono programmi più adatti a questo tipo di PCR ? grazie a tutti |
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Aldolo
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 31 gennaio 2011 : 19:51:19
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Ciao ragazzi!!!sono nuovo in questo forum!!ecco ho qualche domanda...e spero mi potrete aiutare.Mercoledi ho l'esame di biologia molecolare...ma ho ancora qualche dubbio!!!queste sono alcune domande di esame:
1)Se tratto il platano con ozono, come faccio a vedere se anche in platano viene attivato il gene SOD?
2)Differenze tra colony screening e colony screening pcr?
3)Border primer quando vengono utilizzati??
Grazie mille raga PS sn disperato   |
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Elis
Nuovo Arrivato
Città: To
18 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2011 : 21:39:53
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| Ciao a tutti! esiste un tool su internet dove posso inserire FACILMENTE diverse coppie di primer e vedere se formano primer-dimer? |
What does a fish know about the water in which it swims all its life? (A. Einstein) |
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