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brambifix
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13 Messaggi |
 Inserito il - 07 aprile 2016 : 09:18:54
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Buongiorno, il subject della mia ricerca è Leishmania, ho dei parassiti transfettati con luciferasi che ho dovuto confrontare con il corrispettivo "parent" senza il gene della luciferasi in test di suscettibilità ai classici farmaci utilizzati in terapia. Vorrei dimostrare che non c'è differenza statisticamente significativa tra la risposta del parent e la risposta del derivato parassita transfettato, quale test statistico dovrei usare in excel? Aggiungereste anche due righe di spiegazione del suddetto test?
Grazie della disponibilità,
Cordiali saluti Andrea
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Glubus
Utente Junior
156 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2016 : 10:01:56
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Citazione:
Messaggio inserito da brambifix
... aggiungereste anche due righe di spiegazione del suddetto test?
Ciao Andrea,
Io aggiungerei due righe per spiegare l'esperimento. :)
Ad esempio - ma l'elenco non è esaustivo - a me non è chiaro a quale misura di effetto a cui sei interessato (si tratta di conteggi, proporzioni, tassi, ...?) e neppure quale sia l'unità di osservazione (cellula, piastra, animale, ...).
Quanti farmaci vorresti utilizzare?
I farmaci li utilizzerai allo stesso dosaggio o a dosaggi crescenti?
C'è un gruppo di controllo?
Quale è la dimensione dell'effetto atteso?
Questa ultima domanda in particolare ti serve per cautelarti dalla possibilità di non potere rigettare l'ipotesi nulla quando una differenza fra i "trattamenti" esista davvero.
Sono sicuro che se vorrai chiarire nel dettaglio l'esperimento, di modo che sia comprensibile anche a chi non sia necessariamente esperto in parassitologia, potrai ottenere qualche aiuto (non necessariamente sul'utilizzo di Excel però).
Ciao,
GB
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brambifix
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2016 : 10:28:11
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Ok, cerco di essere più chiaro e spiegare in dettaglio quanto ho fatto. Come ho già detto ho una linea di Leishmania infantum transfettata con luciferase firefly gene ed una linea priva del gene transfettato che chiamo Parent. La suscettibilità di entrambe le linee è stata testata contro Antimonio pentavalente e trivalente, miltefosina e paromomicina. Ho eseguito una colorazione GIEMSA con lo scopo di trovare L'IC50, la concentrazione di farmaco che inibisce del 50% l'infezione del parassita. In ogni piastra da 96-well è presente un controllo negativo (macrofagi senza parassita) ed un controllo positivo (macrofagi infettati ma senza trattamento). Ogni test è già stato eseguito minimo tre volte raccogliendo così 6 dati di IC50 per ogni farmaco testato per ogni linea (in ogni piastra ho trattato i parassiti con lo stesso farmaco per due volte). I farmaci sono stati usati alla stesso dosaggio iniziale con una serie di diluizioni seriali, tra le due linee le concentrazioni sono identiche. Ora vorrei confrontare statisticamente i dati ottenuti per ogni farmaco della linea transfettata con i corrispondenti dati ottenuti dal trattamento con lo stesso farmaco della linea parent.
Ora non mi è chiaro cosa significhi la misura di effetto a cui sono interessato e la dimensione dell'effetto atteso...
grazie per la tempestività nel rispondere, avrò il meeting con il boss all'inizio di settimana prossima quindi mi preme risolvere questi dubbi il più in fretta possibile. |
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Glubus
Utente Junior
156 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2016 : 10:53:06
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Grazie Andrea,
Controllo negativo e controllo positivo servono solo a verificare che le condizioni sperimentali fossero corrette vero? (non entrano nella analisi non essendo qui misurata la IC50 se ho capito bene).
Mi spieghi meglio quante piastre vengono usate? Le misure all'interno della stessa piastra possono essere considerate secondo te indipendenti? (la variabilità fra piastre può essere ignorata?)
Purtroppo temo che il disegno del tuo studio sia un po' troppo complesso per una analisi "semplicistica" con excel, nel senso che forse un impegno sperimentale così complesso meriterebbe un approccio più "specialistico".
GB
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brambifix
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2016 : 11:26:58
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| Il controllo negativo per verificare se i macrofagi erano presenti qualora non li trovassi negli altri wells della piastra, il controllo positivo invece lo prendo come riferimento come 100% di infezione. Differenti parassiti esibiscono differente infection rate cosi uso il controllo positivo di ognuno per capire in che diluzione ho circa il 50% di infezione. Per ogni parassita ho una piastra che presenta 8 righe e 12 colonne, ogni colonna rappresenta una diluzione seriale ad eccezione della prima dove ci sono i controlli, ogni riga contiene una diluizione seriale del farmaco ed essendo 4 farmaci in test ho per ogni piastra due ripetizioni di ogni farmaco (ecco perchè su 3 esperimenti uguali ho 6 dati di IC50 per ogni farmaco). Io analizzo indipendentemente i farmaci tra loro ma li voglio correlare tra le due linee, transfettato e parent. La variabilità fra più piastre infettate con lo stesso parassita c'è e viene attribuita principalmente alla biologia dato che stiamo giocando con cellule, parassiti e microlitri di farmaci. Tralasciando le differenze tra piastre con lo stesso parassita (ho eliminato alcuni dati che discostavano notevolmente dagli altri), il punto della faccenda è dimostrare statisticamente che la variabilità rilevata tra il transfettato ed il parent è solo biologica e non dovuta ad una reale differenza di risposta al trattamento. Io pensavo di utilizzare un T.test ma non sono riuscito a cavarmela fuori e quando ho chiesto in lab un consiglio ad una collega mi ha complicato notevolmente la faccenda. Lavorando all'estero ci sono ovvie imprecisioni nella comunicazione, per questo sto chiedendo un consiglio in un forum italiano. |
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Glubus
Utente Junior
156 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2016 : 12:12:34
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Bene
il t-test è un test sulla differenza fra due medie campionarie, mentre qui tu hai l'effetto delle linee di parassita (due livelli) l'effetto dei farmaci (4 livelli) e l'effetto della diluizione (8 livelli) su un outcome, che sarebbe la percentuale di inibizione (correggimi se sbaglio, da quanto capisco l'IC50 è calcolata per interpolazione).
Se è così considera anche che una percentuale è si una variabile continua ma limitata agli estremi (0-100%) e quindi va trattata con cautela (non sempre un modello lineare come l'ANOVA, la regressione lineare o anche il t-test è adatto).
Come prima impressione un modello lineare generalizzato potrebbe essere la cornice all'interno della quale ottenere la risposta alla tua domanda. Il consiglio finale è comunque quello di cercare l'aiuto di un biostatistico.
GB
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brambifix
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 07 aprile 2016 : 12:53:01
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L'IC50 di ogni farmaco su ogni parassita è calcolato con analisi diretta al microscopio, si contano quanti macrofagi sono presenti e il numero di parassiti presenti per ogni macrofago e poi relazioni il numero trovato per il controllo positivo con quelli dei trattamenti scorrendo nella diluizione finchè non trovi approssimativamente il 50% di infezione. Non ho ben capito la tua suddivisione dei livelli. Ogni farmaco avrà un IC50 diverso per ogni parassita che rimane più o meno costante nelle ripetizioni. Gli unici due livelli che vedo io sono le due linee di parassita che sono differenti.
Scusami per la confusione, ma sono cinque anni circa che non riprendo in mano la statistica. |
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TMax
Utente Junior
Prov.: BG
Città: Capriate
270 Messaggi |
Inserito il - 08 aprile 2016 : 09:52:43
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Sembrerò poco costruttivo, ma non si può fare il ricercatore se prima non si hanno basi solide almeno sul disegno sperimentale. Non dico di essere esperti di statistica ma un minimo di base comune è fondamentale per poter dialogare con profitto con un biostatistico. Cosi come uno statistico deve almeno conoscere i fondamentali della biologia. Auguri |
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brambifix
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2016 : 13:55:26
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| Hai perfettamente ragione TMax, ora mi ritrovo in un ambiente alquanto ostile in cui non è facile dialogare con la mia mentor e non è neanche colpa mia se in una laurea triennale ed una specialistica ho avuto solo un esame di statistica al primo anno di tre crediti. |
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TMax
Utente Junior
Prov.: BG
Città: Capriate
270 Messaggi |
Inserito il - 11 aprile 2016 : 20:15:28
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Allora ti consiglio di armarti di pazienza e buona volontà e approfondisci la statistica che ti servirà nel tuo lavoro.... non sarà tempo perso.
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brambifix
Nuovo Arrivato
13 Messaggi |
Inserito il - 12 aprile 2016 : 08:59:33
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Consiglio ben accetto che seguirò sicuramente. Grazie e buona giornata  |
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