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H2O
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 Inserito il - 07 luglio 2010 : 10:40:51
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Ciao a tutti, vorrei costruire dei primer per la Real Time-PCR e sto utilizzando Beacon Design però vorrei sapere se i primer che mi ha disegnato sono specifici per la sequenza che voglio studiare. Che parametri devo rispettare per sapere se i miei primer sono specifici per una data sequenza? Ho inoltre provato ad allineare i miei primer con altre sequenze tramite BLASTN e mi ha dato come risposta tante sequenze; anche in questo caso quali sono i parametri e i range da rispettare? grazie.
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stefanken
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Inserito il - 08 luglio 2010 : 09:16:09
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Potresti provare a verificare i tuoi primer con la In-Silico PCR di UCSC
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr
dovrebbe dirti esattamente quali regioni genomiche amplificheresti.
Saluti |
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H2O
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32 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2010 : 09:43:35
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| la regione che andiamo ad amplificare la conosco, quello che mi interessa sapere è se questi primer che ho costruito sono specifici e che non vadano ad amplificare altre vsequenze che non sono di mio interesse. Ho provato ad utilizzare BLASTN ma essendo sequenze piccole le lega a tante altre e non sapendo come interpretare tutti i vari parametri (E value, score etc.) non so bene come interpretare i risultati. |
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kORdA
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Prov.: Milano
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1303 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2010 : 10:06:29
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Credo che il nucleotide blast ti serva molto poco in questo frangente, anzi e' stradocumentato che i programmi di allineamento tradizionali non vanno assolutamente bene per sequenze molto brevi (v. ad esempio le problematiche inerenti a predire i target dei miRNA)
...ma purtroppo qui non siamo tutti bioinformatici esperti
Oltre ad UCSC in rete ce ne sono un'esagerazione di simulatori di PCR. Cosa ti e' uscito da uno di questi??? |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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H2O
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Inserito il - 08 luglio 2010 : 13:35:42
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| allora, noi stiamo cercando di capire se i primer che stiamo cercando rischiano di amplificare sequenze NON di nostro interesse! ecco perche alla fine abbiamo utilizzato BLASTN, mentre UCSC (che tra l'altro conosco) mi allinea solamente i primers. grazie :) |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2010 : 14:44:50
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Che allineamenti ti vengono fuori?
Con quale percentuale di identita'?
Quanto sono estesi i gaps?
Quanto sono gli e-value degli allineamenti top rank?
Quante sequenze allineano ad entrambi i primer?
Sicuri che le sequenze allineate non siano ridondanti?
Hai provato anche con BLAT? |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2010 : 15:17:32
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Su NCBI c'e' Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) e danno questi consigli:
Citazione:
Things you can do to maximize the chance of finding primers specific for your template.
* Use refseq accession or GI (rather than the raw DNA sequence) as template whenever possible. In addition, make sure you are using the latest version of a refseq entry (i.e., the accession with the highest version number or simply just use the accession without the version number as you will automatically get the latest version).
Even if you are only interested in part of the sequence (for example, a region on chromosome), you should still use the accession or GI but you do need to specify the range (use forward primer "From" field for your sequence start position and reverse primer "To" field for your sequence stop position). The reason is that an accession or GI carries accurate information about its identity which allows primer-blast to better distinguish between intended template and off-targets.
* Choose a non-redundant database (such as refseq_rna or genome database). The nr database contains redundant entries which can interfere with the process of finding specific primers.
* Specify an organism for database search if you are only amplifying DNA from a specific organism. Searching all organisms will be much slower and off-target priming from other organisms are irrelevantThings you can do to maximize the chance of finding primers specific for your template.
* Use refseq accession or GI (rather than the raw DNA sequence) as template whenever possible. In addition, make sure you are using the latest version of a refseq entry (i.e., the accession with the highest version number or simply just use the accession without the version number as you will automatically get the latest version).
Even if you are only interested in part of the sequence (for example, a region on chromosome), you should still use the accession or GI but you do need to specify the range (use forward primer "From" field for your sequence start position and reverse primer "To" field for your sequence stop position). The reason is that an accession or GI carries accurate information about its identity which allows primer-blast to better distinguish between intended template and off-targets.
* Choose a non-redundant database (such as refseq_rna or genome database). The nr database contains redundant entries which can interfere with the process of finding specific primers.
* Specify an organism for database search if you are only amplifying DNA from a specific organism. Searching all organisms will be much slower and off-target priming from other organisms are irrelevant
quindi, stando a quanto dicono loro io mi prenderei il RefSeq corrispondente della tua sequenza di interesse e comincerei da li. |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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H2O
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32 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2010 : 16:29:56
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| Aspetta una cosa per volta, non sono pratico di questi programmi, ALLORA HO IL 100% degli allineamenti con la mia sequenza con e value di 0,010 con uno score 32. Se metto Reference mRNA sequence non mi considera la mia sequenza di riferimento che è tutta mRNA codificante. Lo allinea nella sequenza di mRNA dove c'è anche parte non codificante. Non capisco perchè... Vabbè... Il 100% lo dà solo con la mia sequenza ma porzioni dei primer si possono ovviamente legare anche ad altre sequenze con e value tipo 4 o 9 e score 26. |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
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H2O
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32 Messaggi |
Inserito il - 08 luglio 2010 : 18:32:08
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| Si grazie l'avevo già visto, ma purtroppo non spiega bene la parte dove alla fine dice che si allinea con molte sequenze. E' ovvio che una sequenza corta come un primer non si allinei solo ed esclusivamente alla sequenza di interesse, ma quello che credo sia importante è sapere come interpretare gli score, e value etc etc. Ti permette di fare una prima scrematura ma ti ripeto non sono esperto di quei parametri e non saprei bene come considerare il tutto nel globale. Grazie lo stesso. |
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stefanken
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39 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2010 : 12:46:54
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vorrei aggiungere delle considerazioni:
- UCSC in silico PCR non si limita ad allineare i primers ad uno ad uno, come devi fare per forza con BLASTN, ma li considera come quello che sono: primers. Verifica se (e dove) si produce un amplificato compatibile con i parametri in input (che purtroppo però sono solo lunghezza amplificato e quantità di perfect e good match). In sostanza, se fai una query tilizzando i tuoi 2 primers e UCSC ti ritorna solo una regione i tuoi primers sono specifici, se ti ritorna più di una regione, in PCR amplificheresti cose diverse. Il problema semmai è il DB che usa e chè l'assembly genomico, che non va bene per l'applicazione che si riferisce a RNA maturo.
- Blastn non è progettato per verificare la specificità dei primers. Primo perché non lavora bene con lunghezze così piccole e poi perché, utilizzando la funzione identità, non ha nessun modo di valutare la componente energetica (ad esempio la differenza tra un appaiamento A-U ed uno C-G). I valori che ti fornisce sono valutazioni statistiche sulla possibilità che un allineamento (che comunque c'è!) avvenga per caso piuttosto che per una similarità ricollegabile ad una ipotetica relazione evolutiva.
- La fregatura più grossa è che se anche si fosse in grado di stabilire una relazione tra score di blast e TM del primer (e non si può perché BLASTN fa altro, basta vedere la lista di applicazioni per cui BLAST è stato realizzato, nella pubblicazione originale) questa considerazione va estesa alla coppia di primer, che devi sempre analizzare uno per uno: anche se trovi un ipotetico hit con un primer, devi sempre andare a vedere se l'hit del secondo primer è in una posizione compatibile con l'amplificazione, in oltre le 2 temperature di annealing devono essere vicine e adatte.
A questo punto se utilizzi primer blast, ti conviene inserire direttamente la porzione di sequenza che ti interessa (invece dell'id della sequenza) così sei sicuro che la ricerca dei primers viene effettuata dove c'è bisogno.
Puoi settare la termodinamica dei primers, ma solo in fase di ricerca: il controllo della specificità (che è la cosa che ti interessa), si basa sempre e solo (vedi opzioni in basso nella pagina di submission) su quantità/qualità mismatch e lunghezza amplificato. Quindi alla fine è sempre come disegnare primers con primer3 e verificarli con UCSC pcr col (grande) vantaggio però che con primer blast puoi settare un db di soli RNA....
Saluti
Stefano |
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H2O
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32 Messaggi |
Inserito il - 09 luglio 2010 : 13:31:32
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come ho giá detto non sono molto pratico di blast e ucsc e mettendo i primers da me disegnati ho visto che mi riporta solo all'amplificato atteso ma se i primers non fossero altamente specifici il programma mi riporterebbe anche gli amplificati non desiderati?
grazie |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
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Inserito il - 09 luglio 2010 : 14:58:04
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Scusami H2O, vorrei chiederti una cosa che non ho ancora capito, e forse e' meglio definire una cosa prima di continuare a girarci intorno...
Quante e quali sono le sequenze top rank (a parte quella che stai cercando) che con BLASTn allineano bene entrambe le sequenze primer? Quali sono i loro codici di accesso? Potrebbe darsi, come spesso accade in BLAST se la ricerca non e' stringente, che siano sequenze ridondanti...
A prescindere dagli allineamenti in se' non saprei dirti quale sarebbe il thresold di indel e/o mismatch x definire sufficientemente specifico l'appaiamento di un primer. Quoto in pieno stefanken sul fatto che BLAST non e' uno strumento ottimale per allineare sequenze brevi ma io purtroppo non ne conosco altri (o meglio, uso algoritmi di miRNA target prediction ma non vanno assolutamente bene per i primer) |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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