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Luna B.
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 Inserito il - 10 maggio 2012 : 18:59:30
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Buonasera a tutti...
sto studiando le ttecniche per l'analisi dell'espressione dei geni ed in particolare microarray che fortunatamente ho capito :),e anche la tecnica CAGE di cui invece ho del materiale in inglese ma che non riesco proprio a comprendere...
An alternative new high-throughput approach to gene expression analysis is cap analysis of gene expression (CAGE) sequencing.
-CAGE is a relatively new technology introduced by Carninci and colleagues in which the first 20 to 21 nucleotides at the 5' ends of capped mRNAs are extracted by a combination of cap trapping and cleavage by restriction enzyme MmeI.
- Recent development of the deepCAGE protocol employs the EcoP15 enzyme, resulting in approximately 27-nucleotide-long sequences.
- The 'CAGE tags' thus obtained can then be sequenced and mapped to the genome.
Fino a qui ho capito che i primi 21 nucleotidi dell'mRNA vengono estratti grazie all'azione di enzimi di restrizione come MMel e più recentemente di EcoP15,ed i frammenti così ottenuti vengono sequenziati ed individuata la loro posizione all'interno del genoma...
ma da qui in poi sia per problemi con l'ingelese che proprio di concetti come TSS che non avevo mai sentito prima non riesco a capire:
-In this way a genome-wide picture of transcription start sites (TSSs) at single base-pair resolution can be obtained.
With the advent of deep sequencing technologies it has now become practical to sequence CAGE tag libraries to much greater depth, providing millions of tags from each biological sample.
- At such sequencing depths significantly expressed TSSs are typically sequenced a large number of times.
- It thus becomes possible to not only map the locations of TSSs but also quantify the expression level of each individual TSS
There are several advantages that deep-sequencing approaches to gene expression analysis offer over standard micro-array approaches.
- First, large-scale full-length cDNA sequencing efforts have made it clear that most if not all genes are transcribed in different isoforms owing both to splice variation, alternative termination, and alternative TSSs .
-One of the drawbacks of micro-array expression measurements has been that the expression measured by hybridization at individual probes is often a combination of expression of different transcript isoforms that may be associated with different promoters and may be regulated in different ways.
- In contrast, because deep sequencing allows measurement of expression along the entire transcript the expression of individual transcript isoforms can, in principle, be inferred.
CAGE-tag based expression measurements directly link the expression to individual TSSs, thereby providing a much better guidance for analysis of the regulation of transcription initiation.
- Other advantages of deep sequencing approaches are that they avoid the cross-hybridization problem that micro-arrays have, and that they provide a larger dynamic range
So che chiedo tanto ma potreste aiutarmi a semplificare questi concetti per capire in linea di massima questa tecnica?
Grazie!
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Selenocisteina
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64 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2012 : 10:46:26
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Ti scrivo quello che ho capito io leggendo il tuo messaggio (non conoscevo il metodo precedentemente). Posso benissimo aver scritto castronerie perciò correzioni sono benvenute :D :
Citazione:
Messaggio inserito da Luna B.
in which the first 20 to 21 nucleotides at the 5' ends of capped mRNAs are extracted by a combination of cap trapping and cleavage by restriction enzyme MmeI.
- Recent development of the deepCAGE protocol employs the EcoP15 enzyme, resulting in approximately 27-nucleotide-long sequences.
- The 'CAGE tags' thus obtained can then be sequenced and mapped to the genome.
Prendono il pool di mRNA da una cellula, lo retrotrascrivono a cDNA, fissano il cap (l'estremità 5') a qualche substrato solido con cap-trapping (io conosco il metodo di legare il cap alla biotina e poi purificare con avidina; però possono esserci anche altre metodologie); il metodo usato in questo caso per il cap-trapping viene spiegato qui, ma al momento non ho l'accesso: http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n3/full/nmeth0306-211.html
Quindi, incubano tutti gli mRNA legati a colonna con un enzima di restrizione, che taglierà in un punto casuale dell'mRNA o a un numero di nucleotidi fisso dal cap (questo non è specificato in quello che hai postato). A questo punto in ogni caso hai:
- resina a cui è ancora legato il cap, a cui rimane legata anche la parte "prima" del taglio dell'mRNA perché è legata ancora al cap
- parte "dopo" il taglio che viene eluita via dalla colonna perché non ha più una biotina quindi non rimane più attaccata
A questo punto stacchi dalla colonna anche le parti prima, e avrai una serie di cap + primi 21 nucleotidi dell'mRNA (perciò quello che avevi capito mi sembra giusto).
A questo punto i frammenti ottenuti vengono sequenziati e mappati.
Citazione:
-In this way a genome-wide picture of transcription start sites (TSSs) at single base-pair resolution can be obtained.
With the advent of deep sequencing technologies it has now become practical to sequence CAGE tag libraries to much greater depth, providing millions of tags from each biological sample.
- At such sequencing depths significantly expressed TSSs are typically sequenced a large number of times.
Tu hai purificato, sequenziato e mappato una serie di frammenti di DNA che partono dal cap e vanno fino a circa 21-27 nucleotidi da lì. Perciò hai una serie di "inizi" dell'mRNA, il cui inizio a sua volta corrisponde al punto dal quale la RNA polimerasi ha iniziato a trascrivere per fare quell'mRNA. Siccome - soprattutto in Eucarioti - non è sempre possibile predire computazionalmente dove inizi la trascrizione di un gene, perché non inizia dall'AUG (prima c'è la 3' UTR) né da una sequenza fissa, questo è molto utile per trovare precisamente il primo nucleotide da cui inizia l'mRNA.
Questo può essere utile, per esempio, per trovare le sequenze regolatrici della trascrizione. Infatti, se tu sai che circa a -30 dal sito di inizio della trascrizione ci deve essere, chessò, la TATA box, in questo modo tu hai mappato dove è iniziata la trascrizione di quel gene e puoi cercare se attorno al -30 rispetto al primo nucleotide si trovi una sequenza simile alla TATA box. Ovviamente le applicazioni per cui serve trovare il preciso sito di inizio della trascrizione sono molte altre!
TSS vuole dire "Transcription Starting Site", ovvero sito di inizio della trascrizione.
Citazione:
- It thus becomes possible to not only map the locations of TSSs but also quantify the expression level of each individual TSS
Inoltre, siccome tu hai purificato direttamente gli mRNA, amplificandoli nel modo corretto quando poi vai a sequenziarli avrai una quantità di cDNA proporzionale al numero di mRNA con quella sequenza che avevi nel campione di partenza: se avevi 3 mRNA per un gene sequenzierai 3 volte quella sequenza, 10 10 volte etc. In questo modo hai anche un dato sull'espressione dei vari Transcription Starting Site (per esempio, su un gene potresti trovare più di un sito di inizio della trascrizione diverso, il che è abbastanza comune in Eucarioti, però uno è espresso 10 volte tanto l'altro, quindi significa che è preferito in qualche modo).
Citazione:
There are several advantages that deep-sequencing approaches to gene expression analysis offer over standard micro-array approaches.
- First, large-scale full-length cDNA sequencing efforts have made it clear that most if not all genes are transcribed in different isoforms owing both to splice variation, alternative termination, and alternative TSSs .
-One of the drawbacks of micro-array expression measurements has been that the expression measured by hybridization at individual probes is often a combination of expression of different transcript isoforms that may be associated with different promoters and may be regulated in different ways.
- In contrast, because deep sequencing allows measurement of expression along the entire transcript the expression of individual transcript isoforms can, in principle, be inferred.
I vantaggi di questo metodo sono che ovviamente troverà per ogni gene TUTTI i siti di inizio della trascrizione diversi che vengono usati, mentre i microarray no, perché per fare un microarray si deve conoscere già la sequenza dell'mRNA da far ibridare, Magari, se quell'mRNA a volte ha un ulteriore pezzo all'inizio che non è mai stato notato prima, con un microarray non potrai accorgertene perché l'oligonucleotide corrispondente a quel pezzo non ci sarà sul microarray (spero si sia capito cosa intendo dire). Oppure, potresti avere tanti trascritti dello stesso gene in realtà diversi tra di loro (isoforme, spero che tu conosca già questo concetto), ma che siccome hanno pezzi in comune ibridano tutti negli stessi punti dando la falsa impressione che una sola forma (l'unica che c'è sul microarray) abbia un'espressione assoluta molto più alta.
Invece, con il CAGE tu semplicemente sequenzi tutti i frammenti e poi li mappi, perciò non hai bisogno di nessuna informazione a priori sugli mRNA con cui fare un confronto, e ti basta avere solo un genoma su cui mapparli per poter riconoscere a che gene corrispondono e in che punto iniziavano.
Citazione:
CAGE-tag based expression measurements directly link the expression to individual TSSs, thereby providing a much better guidance for analysis of the regulation of transcription initiation.
- Other advantages of deep sequencing approaches are that they avoid the cross-hybridization problem that micro-arrays have, and that they provide a larger dynamic range
Questo mi pare più o meno il riassunto di quanto già detto. Comunque ti consiglio di leggerti anche l'articolo che ho linkato, perché per quanto possa essere faticoso è la cosa più comoda per capire davvero.
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Luna B.
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16 Messaggi |
Inserito il - 11 maggio 2012 : 19:05:31
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| Grazie mille davvero...oggi mi sono dedicata a questo e grazie alla tua espiegazione con annessi esempi e all'articolo che mi hai postato,mi è tutto più chiaro...certo non mi sembrano,a dir la verità,concetti molto semplici,però almeno non brancolo nel buio come prima...è stato un aiuto prezioso :) |
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Luna B.
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 22 maggio 2012 : 12:24:16
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Ritornando sulle tecniche per l'analisi dell'espressione genica,oltre a microarray,la tecnica CAGE c'è anche poi l'analisi seriale dell'espressione genica(SAGE)...a proposito di SAGE mi sapete dire se ho capito bene?
Si ha l'isolamento dell'mRNA e sua concevesione in cDNA che tramite enzimi di restrizione viene segmentato in piccoli frammenti(tag di 10-14 paia di basi)) che vengono poi attaccati a formare lunghe molecole di DNA che vengono clonate e sequenziate,così dal numero di volt in cui compare questa corta sequenza si può quantificare l'abbondanza del messaggero e così indirettamente il livello die spressione del gene...giusto?
Ed un'ultima cosa :)...sempre tra queste tecniche di analisi di espressione genica c'è una che si basa su sequenze parziali di cDNA,ossia il sequenziamento di EST(anche se nelle dispense ho che si chiama Digital Differential Dsisplay DDD)...qualcuno,per favore, potrebbe spiegarmi in maniera semplice in cosa consiste questa ulteriore tecnica? |
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drop_
Nuovo Arrivato
18 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2012 : 10:19:08
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Citazione:
Messaggio inserito da Luna B.
Ritornando sulle tecniche per l'analisi dell'espressione genica,oltre a microarray,la tecnica CAGE c'è anche poi l'analisi seriale dell'espressione genica(SAGE)...a proposito di SAGE mi sapete dire se ho capito bene?
Si ha l'isolamento dell'mRNA e sua concevesione in cDNA che tramite enzimi di restrizione viene segmentato in piccoli frammenti(tag di 10-14 paia di basi)) che vengono poi attaccati a formare lunghe molecole di DNA che vengono clonate e sequenziate,così dal numero di volt in cui compare questa corta sequenza si può quantificare l'abbondanza del messaggero e così indirettamente il livello die spressione del gene...giusto?
Ed un'ultima cosa :)...sempre tra queste tecniche di analisi di espressione genica c'è una che si basa su sequenze parziali di cDNA,ossia il sequenziamento di EST(anche se nelle dispense ho che si chiama Digital Differential Dsisplay DDD)...qualcuno,per favore, potrebbe spiegarmi in maniera semplice in cosa consiste questa ulteriore tecnica?
Ciao! Anche io sto studiando queste tecniche in vista di un esame...su SAGE mi sembra tutto corretto quello che hai scritto...per quanto riguarda la tecnica di analisi dell'espressione basata su EST io ho capito che le frequenze dell'EST corrispondenti ad un gene forniscono una misura del livello di espressione di quel gene in una data libreria(in quanto i geni espressi ad alto livello saranno rappresentati da più EST di quelli espressi a livello più basso).
E poi in UniGENE praticamente si possono trovare i geni relativi a questi EST.
Aspetto però una conferma(o una smentita :) ) da qualcuno che ne sa sicuramete si più,dato che anche io sono in fase di studio su questi argomenti!!! |
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Luna B.
Nuovo Arrivato
16 Messaggi |
Inserito il - 23 maggio 2012 : 20:52:45
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| Si Infatti su SAGE sono abbastanza tranquilla di aver capito,invece sulla tecnica basata sugli EST ho più difficoltà...grazie cmq :)...magari se qualcuno ne sa di più ci aiuta a capire ad entrambi :) |
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paolo71
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 10 ottobre 2012 : 17:58:23
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salve ,
sono nuovo , volevo sapere come posso quantificare un gene target n1 utilizzando il 18s come reference su un solo campione senza avere il con un controllo ? scusate ma non so quale formula usare.
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Tecniche per analisi espressione geni
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