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domenico1616
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 Inserito il - 29 gennaio 2016 : 16:17:07
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Salve, avrei alcune domande riguardanti le simulazioni di dinamica molecolare.
Quali sono le esigenze che potrebbero portare a fare una simulazione md? Ovvero quali sono le domande a cui si cerca risposta grazie a questi software.
Ho trovato molete informazioni piuttosto vaghe al riguardo, oppure troppo complesse.
Soprattutto per quanto riguarda la parte dell'analisi successiva alla simulazione, tipo rmsd, rmsf ecc.
Ho seguito alcuni tutorial per fare una simulazione con Gromacs, però non sono sicuro di aver compreso fino in fondo quello che ho fatto.
Questo è il file da cui sono partito: http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1i37.
Qualsiasi aiuto sarebbe veramente apprezzato.
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kORdA
Utente Attivo
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Inserito il - 30 gennaio 2016 : 15:32:56
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Non ho capito bene: hai seguito tutorial per fare simulazioni MD per quale scopo? I motivi per fare una simulazione di dinamica molecolare sono tantissimi, non basterebbe un post per spiegarli.
Detto in termini estremamente riduttivi una simulazione MD ti permette di esplorare il comportamento dinamico di una macromolecola, cosa quasi impossibile da prevedere analizzando esclusivamente le strutture "statiche" risolte sperimentalmente via NMR o X-ray.
Occorre sottolineare il prefisso "macro". Nelle simulazioni MD si usano i termini della meccanica molecolare impiegando campi di forze che, se da una parte offrono una buona approssimazione per simulare grossi sistemi, dall'altra non garantiscono un sufficiente dettaglio atomistico nel caso di piccole molecole.
Accanto alla dinamica molecolare classica esiste poi un'universo di tecniche MD chiamate "enhanced", adottabili a seconda della caratterizzazione che si intende fare: dall'analisi dei moti collettivi (per indagare i principali moti che presiedono ad un cambio conformazionale), al calcolo della variazione di energia libera, all'esplorazione estensiva della superficie di energia potenziale, etc.
In definitiva, se ci spiegassi che cosa ti ha portato a studiare come si allestisce una MD, ti potremmo fornire un aiuto un po' più mirato. |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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domenico1616
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Inserito il - 31 gennaio 2016 : 10:28:32
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| Grazie della risposta, in pratica ho scaricato il file pdb, ne ho generato la topologia, aggiunto gli ioni per bilanciare la carica, ho eseguito step di minimizzazione dell'energia e di riscaldamento. Quindi ho fatto girare alcune simulazioni md e dalle traiettorie ottenute ho effettuato la parte di analisi. Rmsd, rmsf, raggio di girazione ed analisi degli effetti del solvente (g_sas). Quindi alla fine ho stampato dei file visualizzabili con grace. |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
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Inserito il - 01 febbraio 2016 : 13:58:13
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OK...
rmsd, rmsf e raggio di girazioni sono analisi preliminari per valutare quanto la traiettoria che hai prodotto sia stabile.
La valutazione della superficie accessibile al solvente a cosa ti serve? O meglio, ora che hai prodotto una simulazione MD cosa vorresti andare ad osservare?
Nella entry del Protein Data Bank che hai postato oltre alla proteina c'è un ligando (DHT). Come lo hai parametrizzato? Con quale forcefield? |
http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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domenico1616
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Inserito il - 01 febbraio 2016 : 20:12:14
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Grazie, informazione utilissima quella su rmsd, rmsf e raggio di girazioni.
Ho fatto due simulazioni totalmente separate, una con il DHT ed una senza, con relative rmsd, rmsf ecc ecc finali. Dovrei dunque confrontarle per vedere cosa cambia in presenza di DHT, se ho capito bene quello che dovrei fare ( e soprattutto se ha senso).
Il force field usato è quello standard GROMOS96 43a1. Il DHT l'ho tolto dal .pdb, ne ho scaricato la topologia a parte da ATB e dopo averla salvata nella cartella del FF l'ho inclusa nel file .top.
Ho incluso il dht anche nel file .gro, quindi ci sono sia il ligando che il recettore (il dht funge da ligando per il recettore AR a quanto ho capito, causando una variazione di configurazione).
Mi è stato suggerito di andare ad osservare i grafici ottenuti, per capire in quali parti della proteina ho maggior movimento.
In questo contesto cosa potrei ottenere dalle varie analisi che è possibile fare con Gromacs?
Grazie ancora per l'aiuto! |
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
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Inserito il - 02 febbraio 2016 : 09:07:53
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Innanzitutto tieni sempre presente che hai condotto una simulazione MD classica, quindi non ti aspettare di trovare grossi cambi conformazionali. Tu sei partito da una conformazione holo svuotata del proprio ligando; una MD classica è in grado di scavalcare barriere energetiche relativamente basse, di conseguenza sarà molto improbabile che il sistema riesca ad evolvere verso una struttura che rassomigli la forma apo nativa.
Detto questo partiamo dai profili RMSD. In primo luogo un profilo di RMSD ti dice subito se hai campionato correttamente la tua traiettoria. Se osservi grosse ed improvvise variazioni probabilmente significa che ti trovi in presenza di artefatti generati dalle condizioni periodiche in cui il sistema è stato simulato. Ricampiona quindi la traiettoria filtrando le condizioni periodiche (usando il comando trjconv con l'opzione -pbc nojump ad esempio).
Una volta ricampionata la traiettoria la prima cosa da fare è osservarla direttamente. Esistono software come VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) che ti permettono di caricare la traiettoria completa e visualizzare come si "muove" la proteina.
A questo punto, la cosa da andare a cercare in un profilo RMSD è valutare se i sistemi simulati abbiano raggiunto una fase di equilibrazione. Tipicamente dovresti osservare nei primi nanosecondi una rampa (il sistema si sta progressivamente allontanando dalla conformazione cristallografica) fino a raggiungere una soglia di plateau attorno a cui il sistema oscilla (il sistema è arrivato ad equilibrio). Quando e in che modo il sistema arriva all'equilibrio dipende dalla struttura; ovvio che se la tua proteina è ricca di loop e regioni non strutturate la faccenda si complica.
Un altro indizio che talvolta compare in un profilo è la comparsa di variazioni che si discostano in maniera più o meno evidente dal plateau. Questo potrebbe essere sintomo che la tua proteina va incontro a piccoli cambiamenti conformazionali che potrebbero denotare la presenza di microstati peculiari. Tieni presente sempre che si tratta solo di indizi: fare un'affermazione del genere richiederebbe analisi più approfondite.
Dal profilo RMSF indicativamente potresti individuare quali sono gli amminoacidi maggiormente coinvolti nel sito di binding. Confrontando le simulazioni con o senza ligando dovresti osservare che alcuni picchi variano in intensità. Solitamente questo significa che quei residui, in presenza del ligando, sono per così dire "rigidificati" in vincoli energetici apportati da interazioni di non-legame.
Sulla dSASA (variazione della superficie accessibile al solvente) il discorso si fa invece più fumoso. In linea di principio sarebbe utile per valutare la variazione dei contributi di solvatazione con o senza ligando. In pratica avrebbe senso farla se sai che il tuo sito di binding è localizzato in prossimità della superficie e non è una cavità interna (ricordi che la conformazione holo svuotata del ligando non è una conformazione apo?). Fossi in te, piuttosto, campionerei una serie di snapshot rappresentativi delle simulazioni e su essi andrei a calcolare i volumi interni delle cavità. In questo modo potresti vedere, ad esempio, se il recettore svuotato tenda a "collassare" su sè stesso o, al contrario, tenda ad "aprire" il proprio sito. Per calcolare i volumi esistono servizi online tipo questo http://sts.bioe.uic.edu/castp/calculation.php.
Spero di non averti tediato troppo. Ci sarebbero numerose altre considerazioni da fare, ma se mi dici che stai facendo solo un tutorial credo che questo genere di analisi sia esaustiva.
Per curiosità, che fai di bello nella vita? Sei un tesista, un dottorando, o...? Sarei curioso di sapere in quale gruppo e/o per quale prof stai facendo queste cose...
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http://www.linkedin.com/in/dariocorrada |
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domenico1616
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Inserito il - 02 febbraio 2016 : 19:29:36
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Sono uno studente, le ho inviato altri dettagli su di me per messaggio privato, ma non so se è stato inviato dato che la mia connessione è un po' instabile. Sto preparando una tesi sull'argomento, quindi citandone un estratto vorrei dare maggiori informazioni su quello che ho fatto.
"La simulazione è stata effettuata sul sistema AR/LBD-DHT, in forma holo ed apo, utilizzando il software gratuito Gromacs 4.6.x[citare]. La struttura cristallografica è stata scaricata dalla protein data bank, rispondente al codice 1I37, ottenuta mediante tecnica spettroscopica di diffrazione dei raggi x[citare]. Il force field scelto è stato quello standard, Gromos96 43a1[citare], all'interno del quale è stata inclusa la topologia del DHT, presa dall' Automated topology builder (ATB) database[citare].
Il sistema è stato solvatato con acqua SPC/E[cita] ed incluso in un box cubico di spigolo 7.0 nm, per un totale di 10114 molecole d'acqua per la forma apo. Due ioni Cl- sono stati sostituiti a due molecole di solvente, così da bilanciare la carica del sistema.
In seguito è stato impostato un raggio di cut-off di 1.0 nm per le interazioni di Wdv. Mentre il calcolo delle interazioni a lungo raggio è stato effettuato con il metodo PME (Particles mesh Ewald).[cita]
Sono stati effettuati 100 step di minimizzazione dell'energia, con il metodo “steepest descent” , la maximum step size è
0.01 con tolleranza di 2000 [kJ mol #8722;1 nm #8722;1 ], usata per minimizzare le deviazioni dalla struttura cristallografica.
Quindi il sistema è stato riscaldato, alla pressione atmosferica di 1atm, passando per quattro fasi di heating (con aumento di temperatura di 50K l'una) durante le quali la temperatura è stata portata a 300 K ( da 150K) in 100 ps.
La simulazione è stata fatta girare a temperatura e pressione costanti, 300 K ed 1 atm, per una durata di 3 ns. La configurazione di tutte le traiettorie ed energie è stata salvata ogni 0.002 ps.
L'algoritmo di restrizione SHAKE[citare] è stato utilizzato durante la simulazione per mantenere costante la geometria interna delle molecole di acqua e per mantenere lunghezze di legame di proteine fissata al loro valore di equilibrio."
Leggo però molte cose nel suo commento che mi fanno riflettere ( e non mi tediano affatto, anzi..). Ad esempio che "la conformazione holo svuotata del ligando non è una conformazione apo"
Quindi ho sbagliato? Dovrei ri effettuare la simulazione scaricando la struttura cristallografica del recettore?
Sto ancora ragionando sulle altre cose che mi ha detto al riguardo dell'analisi.
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kORdA
Utente Attivo
Prov.: Milano
Città: Monza
1303 Messaggi |
Inserito il - 03 febbraio 2016 : 12:07:54
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Dammi pure del tu, non necessariamente hai sbagliato...
Se sono disponibili strutture cristallografiche nella forma apo sarebbe preferibile usare quelle, ma non sempre ci sono e bisogna accontentarsi di quello che si ha a disposizione ;-)
Ci sono però molti accorgimenti nel protocollo di simulazione che andrebbero necessariamente rivisti. La "ricetta" che hai seguito funziona bene per un tutorial, dove serve capire come funziona il tutto. Ma non è assolutamente adatta per la produzione e l'analisi effettiva di dati. E' però un discorso troppo lungo da scrivere su un post di un forum.
Ho letto il tuo PM e... diamine!!! Il tuo corso di studi, l'argomento di tesi e la curiosità nel voler utilizzare metodi computazionali calzano tutti e tre a pennello con quello di cui mi sto occupando attualmente (ie homology modelling, docking e dinamica molecolare sul recettore della diossina).
Per i motivi sopra vorrei contattarti e farti qualche proposta, oltre ovviamente a darti una mano sul tuo progetto. Se in PM mi mandi il tuo indirizzo e-mail ti risponderò subiterrimo!
In alternativa sentiti libero di scrivermi su dario.corrada@unimib.it
Attendo tue notizie |
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