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QuizImmaginate di voler capire come funziona un apparecchio elettronico:
lo aprite e ciò che vedete è un ammasso di cavi che vanno da ogni parte… una cosa che potreste fare per cominciare è disegnare una mappa dei fili, segnandovi da dove partono e dove arrivano. Certo, non sarebbe la soluzione finale al vostro problema, ma potrebbe essere un buon punto di partenza.
Studiando il cervello ci si trova spesso di fronte ad un problema simile, ma molto più complesso: un cervello umano contiene approssimativamente 100 miliardi di neuroni di molti diversi tipi e si stima che ciascuno di essi abbia collegamenti (sinapsi) in media con altri 7000 neuroni. Una delle sfide più grandi è quindi capire come questi neuroni siano collegati tra di loro, in modo da poter creare una mappa delle connessioni del cervello.
Un enorme passo avanti in questo senso è stato annunciato in un recente studio apparso sull’ultimo numero di Nature da parte di Jean Livet e colleghi al Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare dell’Università di Harvard (e con uno studio del genere non c’è da sorprendersi che abbiano avuto l’immagine di copertina…).
L’articolo riporta la generazione di varie linee di topi transgenici chiamati “Brainbow”, nome derivato dall’unione di brain (=cervello) e rainbow (=arcobaleno). I neuroni dei topi Brainbow, infatti, emettono fluorescenza in 100-150 colori differenti! Ciò è possibile grazie all’espressione nei neuroni di questi topi di diverse proteine fluorescenti: GFP (verde), YFP (gialla), CFP (azzurro), OFP (arancio) e RFP (rossa). Queste proteine vengono fatte esprimere in modo casuale ed a diversi livelli nei diversi neuroni per generare i diversi colori.
Topi ed altri animali le cui cellule esprimono proteine fluorescenti non sono certo una novità, negli ultimi 10-15 anni si è visto un aumento esponenziale del loro numero. La novità di questo studio è il fatto di avere un così grande numero di colori diversi che permette di seguire facilmente il percorso di un neurone, capire da dove parte e dove arriva e con quali altri neuroni viene a contatto. Sarà infatti probabile che neuroni vicini tra di loro abbiano diverso colore, rendendo così più “semplice” la mappatura delle varie connessioni.
L’articolo mostra anche esempi pratici d’uso di Brainbow come la ricostruzione in 3D di alcuni network cellulari nel cervelletto ed uno studio dell’interazione neuroni-glia.
Per chi fosse interessato all’aspetto più tecnico: il trucco sta nell’utilizzo di un transgene contenente le diverse XFP messe in sequenza in modo tale che solo la prima proteina possa essere tradotta. Le varie XFP sono messe all’interno di siti lox incompatibili tra loro (loxP, lox2272 e loxN) e mutualmente esclusivi; questo in pratica vuol dire che se Cre excide il DNA all’interno di una coppia di questi siti, gli altri non sono più funzionali. Il taglio può avvenire con la stessa probabilità a ciascun sito, portando così all’espressione di una diversa XFP in neuroni diversi. Aggiungete il fatto che diverse copie del transgene possono essere inserite in tandem (una delle linee riportate nell’articolo ha 8 copie del transgene) ed eccovi tutta la variabilità di espressione necessaria per ottenere 100 o più colori diversi!
Una domanda mi sorge però spontanea: supponendo di arrivare ad avere una mappa completa delle connessioni cerebrali, non credete ci troveremo poi in una situazione di stallo su come analizzare la inimmaginabilmente immensa quantità di dati che deriverebbe da questo studio? E come memorizzare questa enorme quantità di dati in un modo accessibile e funzionale?
Ad ogni modo, per ora la cosa migliore da fare è godersi un paio delle fantastiche immagini dei neuroni Brainbow!
E per chi volesse, ecco il link all’articolo (è necessaria una subscription a Nature per vedere il full-text):
Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system – Nature, 2007
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ciao!
volevo dire, se scrivete un post a proposito di un articolo scientifico fate un pensiero ad usare questo:
- http://dalloliogm.wordpress.com/2007/11/11/research-blogging-icon/
Ciao! Grazie della segnalazione, non conoscevo bp3 (devo leggere più spesso il tuo blog…) e mi sembra un’ottima idea!
Lo aggiungo subito al post!
Devo dire che l’argomento è di estremo interesse, tra l’atro ho avuto l’onore di conoscere questo topo all’ultimo Neuroscience a San Diego.
Quando ho visto per la prima volta il poster e poi la presentazione ad essere sincero non ci avevo capito nulla e pensavo che i colori fossero correlati ad un particolare sottotipo neuronale o ad un particolare stadio di riposo/attività cellulare, rendendo estremamente facile individuare i giocatori della rete neuronale.
Poi ho letto l’articolo e mi sono un po’ sconfortato, poiché in fin dei conti con l’uso di 3-4 anticorpi fluorescenti che riconoscono i neuroni potrebbero dare un risultato simile in termini di ricostruzione tridimensionale della rete neuronale, senza far uso di topi transgenici e tutta questa spettacolarità.
Il topo Brainbow potrebbe essere un ottimo metodo di studio per la conformazione della rete nervosa centrale e periferica. Però è veramente molto lontano da quegli strumenti che potrebbero fare effettivamente luce su come i meccanismi funzionano, in questi cervelli non si possono neanche utilizzare degli anticorpi fluorescenti per marcare specifiche proteine poiché sarebbe inutile…
Insomma, direi che le immagini sono più spettacolari che effettivamente utili, dato che come si può leggere anche dall’articolo di conclusioni ne traggono davvero poche.
Nel nostro laboratorio sono stati fatti degli studi simili al microscopio confocale, ma nel nostro caso utilizzavamo degli anticorpi monoclonali diretti contro epitopi che marcano specifiche sottopopolazioni neuronali. I risultati sono meno cromatici ma più significative se si pensa di trovare espressa una proteina in alcuni tipi di neuroni intorno all’area ischemica, e poi solo questi neuroni sopravvivono alla morte neuronale.
Si possono fare lo stesso delle ricostruzioni tridimensionali delle interazioni neurone neurone, ma almeno si sa di quali neuroni si stia parlando.
Insomma, non voglio paragonare il mio o qualche altro laboratorio a questi che hanno pubblicato su Nature, tuttavia non vedo un significativo contributo alla comunità scientifica tale da determinare un grande progresso metodologico o informativo.
Le critiche che ho sentito a San Diego sono state molte, anche se sinceramente non le ricordo per nulla poiché erano in inglese e soprattutto perché non avevo inteso le informazioni sul topo.
Con questo non voglio dire che la tecnica è del tutto inutile, ma semplicemente non credo che aggiungerà molte informazioni su quello che è già stato fatto da altri in tanti anni di ricerca.
Probabilmente, spero, in futuro sarà generato un topo che avrà le singole sottopopolazioni neuronali marcate con diversi colori specifici e questo darà di sicuro un enorme contributo alle neuroscienze, poiché saranno fatte delle mappe del SNC molto più accurate e dettagliate di quelle che avremmo mai potuto immaginare in passato, ovvero localizzare oltre alla anatomia della rete neuronale anche i giocatori specifici coinvolti.
…In attesa di Brainbow 3.0
ciao
Pasquale
Ciao Pasquale.
Devo dire che le tue osservazioni sono giuste, e mi trovi in parte d’accordo, tuttavia io vedrei questo topo più come “proof of principle” che altro.
E’ vero che non ti dà informazioni funzionali, ma questo potrebbe essere risolto ad esempio mettendo il tutto sotto un promotore più specifico di Thy1, per selezionare solo un particolare fenotipo neuronale.
Giustamente tu dici: potrebbero fare la stessa cosa con anticorpi. Questo è vero, ma proteine espresse geneticamente rendono il tutto meno laborioso (e meno costoso una volta che hai il topo). Inoltre, anche se al momento si è solo agli inizi, usando un sistema di imaging in vivo si potrebbero ottenere informazioni sulla plasticità di un certo network al passare del tempo, anche mesi.
Il fatto che nell’articolo non traggano molte conclusioni funzionali lo vedrei più che altro dovuto al fatto che è un articolo riguardante una metodica che per una serie di motivi è arrivato su Nature, ma poteva stare benissimo su Nature Tecniques…
Avendo parlato con una persona che ha lavorato con questi topi ti posso dire che il laboratorio in questione ha anche recentemente finito di sviluppare un nuovo sistema che permette la ricostruzione di interi network neuronali e immagino che unendolo a topi Brainbow si potrebbero cominciare anche ad ottenere dati funzionali.
Detto questo, da bravo “imaging geek” che sono… le immagini continuano a piacermi un sacco!!!
…e riguardo i microrna coinvolti nel meccanismo di sviluppo e regolazione neuronale??? avete qualche novità?
grazie e congratulazioni per il bellissimo blog…(che penso si inizierà a frequentare òlsempre di più!!!!)
a presto.
dabar
Ma, sinceramente non sono aggiornatissimo sui miRNA, ma magari mi aggiorno e scrivo un post a riguardo!
Otiimo nico,
sarebbe bellissimo!
A presto.
dabar
3 punti:
la tecnica sarà secondo me + utile nel mappare il sistema immunitario
il logo pare + un globulo rosso con un neurite
nuture methods!
acidamente ale
: P
Miiiii quanto sei acido Ale!
Comunque, per risponderti:
1) non sono un esperto di immunologia, ma in effetti non sembrerebbe una cattiva idea!
2) il logo l’ha disegnato Ricky…
3) hai ragione! Mi confondevo con Neuron che ha NeuroTechnique