Avevamo parlato degli enzimi di restrizione. A differenza dei tipi I III, i II hanno l'attività di legame e quella di taglio senza l'attività metilasica, questo non significa che non ci sia la metilasi corrispondente, altrimenti questi enzimi in natura non proteggerebbero (non servirebbero). Tutte le metilasi sono state purificate perché vengono anch'esse utilizzate, per esempio, nell'aggiunta di linker ad un inserto da clonare in un opportuno vettore.

Aggiunta di linker.

L'aggiunta di link ad un inserto viene fatta quando abbiamo estremità blunt, in queste condizioni non conosciamo la mappa di restrizione, ma devo mettergli il linker, con gli oligonucleotidi sintetici, il quale contiene siti di restrizione che ne permettono il clonaggio.

Sperimentalmente si procede così:
Ho isolato il frammento blunt, costruisco e sintetizzo l'oligo col sito EcoR1 + basi aggiuntive altrimenti EcoR1 non taglia, quindi costruisco un filamento artificiale double strand di DNA col sito EcoR1 + xxxxxx basi, necessarie perché EcoR1 si possa legare e poi dare l'idrolisi. Il linker viene saldato attraverso l'azione della ligasi di T4, che poi vedremo, dopodiché taglio il ligato con EcoR1 per avere le estremità (sticky ends) per poterlo clonare all'interno di un vettore linearizzato a sua volta con EcoR1.
Prima di aggiungere i linker si metilano i siti (in questo caso Eco) del frammento originale, per impedire che quando vado a tagliare con Eco il frammento si sia spezzettato.
Riassumendo:  Isolamento -> metilazione-> aggiungo linker-> taglio-> clonaggio.

Esistono quindi tutte le metilasi corrispondenti agli enzimi di restrizione di tipo due.
Questo porrà dei problemi sulla mappa di restrizione successica al clonaggio, x' se ho metilato tutti i siti Eco, questi non verranno tagliati da Eco. Ma con il sequenziamento del DNA potrò sapere quanti siti Eco c'erano.

Isoschizomeri e metilasi.
Gli isoschizomeri hanno proprietà diverse anche in riferimento alla metilazione del loro sito di riconoscimento: una metilasi riconosce lo stesso sito, ma il comportamento dell'isoschizzomero corrispondente è diverso (può tagliare un sito metilato e un altro può non tagliarlo).
Sfrutto questo fatto per studiare il livello (grado) di metilazione di certi siti: perché la metilazione, come pure la presenza di enzimadi restrizione è specifica per ogni organismo: noi abbiamo metilasi che non ci sono in E.coli, i vertebrati superiori hanno un DNA estremamente ricco in GC rispetto a E.coli, per cui è probabile che ci siano metilasi che riconoscano seq, GC rispetto ad AC. Come sfrutto questa cosa?
In E.coli la metilasi che riconosce la sequenza CCGG non c'è, quindi se del DNA di vertebrato con questa sequenza è introdotto nel E.coli, non viene metilato e se digerisco con due isoschizomeri, viene tagliato da tutti e due, e io non so se uno di questi è metilato o se sono metilati tutti e due, ma se uno è metilato e l'altro no se questo è clonato in E.coli entra replica, non c'è la metilasi, l'elica synth non è metilata, e il DNA finale non è metilato, lo taglio sia con HPO2 che con SP1 e otterrò tre frammenti A, B, C. Se invece non faccio questo passaggio in E.coli ma rimane come l'ho isolato (DNA di vertebrati superiori) avrò a seconda della metilazione un pattern diverso. Tagliando con Msp I che riconosce il sito indipendentemente che sia metilato o no, avrò il pattern uguale a quello ottenuto in E.coli, se uso l'isoschizomero (Hpa II) che non taglia se il sito è metilato, avrò un pattern diverso, dal cfr posso sapere quanti siti sono metilati.
Riassumendo: parto da un DNA che non conosco che ha siti di restrizione per i miei isoschizomeri e non so quanti ne ha metilati, in E.coli non c'è la metilasi per CCGG, quindi se clono questo DNA in E.coli nel passaggio in E.coli  durante la replicazione la metilazione viene persa. Taglio con i 2 enzimi, e in funzione dei siti che ci saranno otterrò un certo numero di bande. I siti non sono metilati, quindi i 2 enzimi mi danno le stesse bande (3 bande = 2 siti). Se il DNA isolato X non lo clono in E.coli ma lo mantengo tal quale, siccome lo isolo da vertebrati è stato metilato in n siti, se lo digerisco con due enzimi uno che taglia indipendentemente dalla metilazione (pattern = a E.coli), uno che non taglia se c'è la metilazione, otterrò pattern diversi a seconda del n° di siti di metilazione. Guardando le bande che scompaiono e le bande che aumentano di intensità (somma) capisco dentro che frammento si trova il sito metilato. Posso analizzare il grado di metilazione dei siti (quando isolo un DNA non so se i siti sono o non sono metilati, in genere isolo DNA da organismi non manipolati, con sistemi di metilazione che funzionano in modo standard).

Metilazione non associata ad attività endonucleasica.
Esistono in E.coli sistemi di metilazione non accoppiati ad endonucleasi specifica, i sistemi principali sono i sistemi dam e dcm.

1. Il sistema dam riconosce la sequenza GATC e metila la A. Purtroppo questa sequenza è presente all'interno di molti siti di restrizione di enzimi quali BamHI, Sau3A e DGL2 che sono quelli che riconoscono sequenza diverse ma lasciano estremità compatibili (isocaudameri)

·         La sequenza GATC può anche essere in parte dentro al sito di restrizione e dare comunque problemi ad alcuni RE come ad esempio CLA, la cui sequenza di riconoscimento è GAT. Se per caso subito dopo c'è una C nella seq, la sequenza viene metilata e CLA non taglia più. La probabilità è, ovviamente, uno su 4.

·         Altri come XDA1 hanno probabilità inferiori: c'è solo GA, ma se dopo c'è una T e una C, (1/16) sarà metilato e non taglia più.

2. Il sistema dcm invece riconosce 2 sequenze, CC^A/_TGG e viene metilata la C.

Perché ci dice questo? Questo è un sistema che funziona in vivo, dentro E.coli, non tutti i ceppi di E.coli che vengono utilizzati in lab mancano di questo sistema di metilazionie, percui se sono presenti questa metilasi noi dobbiamo saperlo: a monte di ogni passaggio in E.coli c'è sempre q.che passaggio in vitro, dove queste metilasi non ci sono.

• Mettiamo che, per riprendere il discorso di prima, ho deciso di fare dei bellissi linker con dei siti XDA o CLA: metilazione in vitro sul frammento->attacco i linker-> taglio->vado a clonare-> trasformo E.coli e se non ho visto che E.coli mancava del sistema dam, il DNA è metilato e una volta che lo recupero e voglio excidere il frammento, non ottengo più niente.

• Oppure voglio fare una mutagenesi e inserisco il sito CLA o XDA all'interno del gene, la mutagenesi si fa in vitro per cui ho tutto sotto controllo, metto a sito attivo, inserisco un sito XDA in modo che poi la proteina corrispondente non è più attiva, tutto bello, trasformo E.coli, questo viene metilato, e ricomincio da capo.

I sistemi che si usano normalmente, non tutti mancano di queste metilasi: per poter utilizzare E.coli in laboratorio dobbiamo modificarlo di parecchio! Devo togliere tutti i sistemi di restrizione, tutti i sistemi di metilazione, devo fare in modo che E.coli (che sta anche nel nostro intestino come commensale) non si propaghi ovunque, se per x motivi mi mangio un E.coli ricombinante. Tutti i E.coli da laboratorio hanno una serie di mutazioni, e q.cosa dobbiamo pur lasciargli, ma non li useremo per le trasformazioni.
Esiste un altro RE, DPM1 che funziona al contrario: riconosce e taglia in modo specifico la sequenza GATC quando la A è metilata, e viene usato quando? quando voglio eliminare q.cosa che mi può dar fastidio, come il templato originale di una PCR.
La PCR prevede una reazione in vitro di polimerizzazione a partire da un templato su cui mettero degli oligo, e amplificherò un frammento X. Il templato di partenza ha tutte le caratteristiche dell'origine da cui l'ho isolato (tutte le sue belle metilazioni e abbastanza frequentemente) il frammento amplificato con PCR invece non ce le avrà.
Alla fine avrò la mia provettina con dentro templato + prodotto, e a me interessa il prodotto. Io devo clonare il prodotto, anche se il templato è pochissimissimissimo ma c'è, e devo eliminarlo. Uno dei modi (ce ne sono altri) è trattare la miscela con DPM1 perché questo idrolizzerà il mio templato e non il frammento, che potrà essere clonato (dopo separazione della mix di digestione).

Metodi di purificazione dei frammenti di restrizione.
Immaginiamo che io abbia digerito con Hind, ho 10 frammenti. Come faccio ad isolare i 2-3 che mi interessano dalla mia miscela? In tutti i casi si carica su gel di agarosio e si ottengono delle bande, si guarda fisicamente al transilluminatore utilizzando lunghezze d'onda diverse da quelle che mi permettono di vedere il DNA, perché non voglio danneggiarlo (devo usarlo!) con un bisturi piccolo piccolo taglio la banda e la metto in una provetta e con kit posso estrarre in modo specifico la banda che mi interessa. Questo passaggio è un po' più lungo rispetto al trattamento dell'idrolizzazione, in cui ottengo frammentini che non rompono il cazzo, invece in questo modo devo:
caricare su gel-> fare correre-> colorare-> andare a guardare-> tagliare-> eluire-> controllare che abbia eluito q.cosa e a quel punto sono pronto (per trasformare?).
I metodi di purificazione sono moltissimi, quando uno lavora mette sempre in conto: tempo, resa e costo.