Classe di enzimi utilizzata in varie metodiche di biologia molecolare:
1. PCR;
2. Sequenziamento;
3. RNA > cDNA;
4. Mutagenesi;
5. Sintesi di sonde marcate
Tutte le polimerasi polimerizzano in direzione 5'>3', ma con alcune differenze, la cui comprensione è fondamentale per la scelta in funzione del tipo di esperimento.
Devo tenere in considerazione:
- Processività
- Cinecità
- Affinità
- Range di temperatura
Il templato idoneo per le polimerasi è DNA a singolo filamento con un primer annilato (appaiato) che esponga un 3'-OH. Tutte necessitano del cofattore Mg⁺⁺ che stabilizza le cariche negative degli acidi nucleici. Il pH optimum è quello fisiologico, eccetto che per la T4 fagica.

DNA pol I di E.coli

Enzima intero (Oloenzima).
L'attività 5' >3' esonucleasica, a differenza di quella 3' >5' eso non è in competizione con l'attività polimerasica. Se non è bilanciabile significa che, a caso, l'enzima allunga da una parte e depolimerizza dall'altra.
A che serve allora?
- Nick Translation:  si parte da dsDNA lo si niccka e di forniscono precursori radioattivi (α-³²P-dNTP).  L'enzima smangia l'elica che trova davanti (5' >3' eso) e ricostruisce l'elica al suo passaggio (5' >3' pol). L'efficienza che è un bilancio tra smangio/attacco arriva al 70%.
- Gap filling:  Serve per bluntare estremità 5'-protruding in entrambi i sensi, dato che polimerizza attaccando nucletidi al 3'-OH sull'elica più corta usando la 5'-protruding come templato. Per regolare la cinetica si gioca sulla concentrazione di substrato fornito.
Se digerisco con pepsina ottengo il grosso frammento di Klenow dotato di due attività in competizione l'una con l'altra:
1. polimerizzazione 5'>3';
2. esonucleasi 3'>5';
È l'ambiente intorno alla polimerasi che decide quale attività deve svolgere.
Questa polimerasi è poco processiva: si stacca dopo circa 30 nucletidi, non va bene quindi per la PCR, ma ha una buona fedeltà dovuta all'attività di proof-reading esonucleasica.
Posso usare la DNApol I per riempire le estremità del 5'-protruding. E se facendolo fornisco dNTP marcati (³²P in α) posso fare una sonda.

T4 DNApol
È simile alla Klenow, ma a livello cinetico l'attività esonucleasica è più efficiente, è utile quindi per bluntare estremità 3'-protruding.

T7 DNApol
Prevale la processività (fino a 400 nucletidi), la variante 'Sequenasi' è usata nel sequenziamento.

Costruzione di sonde
Parto da dsDNA digerito con una esonucleasi in modo tale da ottenere due ssDNA uniti da un piccolo joint di dsDNA. Aggiungo T7pol + dNTP*, otterrò due catene marcate speculari su filamenti opposti.

------------   eso             ---------  T7   *******------
||||||||||||  ----->           ||       ---->  ||||||||||||||
------------           ----------              --------******

Tagliando separando i due filamenti (denaturando o con enzimi di restrizione), otteniamo due sonde in grado di attaccarsi una al filamento senso del DNA, l'altra al filamento complementare. L'utilità è che in questo modo possiamo sapere quale elica del gene viene trascritta usando queste sonde per ibridizzare l'mRNA.

Trascrittasi Inversa
È una DNA polimerasi RNA dipendente, nel senso che usa come templato filamenti di RNA con opportuno primer annealato.
Riesco ad ottenere un ss cDNA appaiato a RNA che degrado con RNasi H.
Ora o fornisco un secondo primer o è lo stesso cDNA che si piega (loop)e fa da primer per se stesso. Ottengo alla fine ds cDNA.

Terminal Transferasi
Attacca code di nucleotidi (anche blunt) senza necessità di templato. Se non c'è Mg⁺⁺ si accontenta di Mn⁺⁺.
Utile per il clonaggio di frammenti blunt di cui non si conosce la sequenza: gli fornisco un solo dNTP (dTTP), poi separo i filamenti allungati con il singolo dNTP fornito (divido --------- da --------TTTT) e uso quest'ultimo per il clonaggio in un inserto con poly(A) protruding: metto insieme un plasmide tagliato in una sequenza di poly(A), e il mio filamento-poly(T); questi si appiano, con polimerasi riempo le basi mancanti, e con ligasi chiudo i nick: ho incluso (clonato), nel plasmide il mio frammento.

DNA polimerasi per la PCR.
Sono termostabili, quindi permettono di allestire cicli di reazione: Cicliamo da 94° , in cui abbiamo denaturazione DNA, a Temperatura ottimale per l'attività enzimatica. Non dobbiamo ad ogni ciclo aggiungo l'enzima (come veniva fatto prima di isolare queste particolari DNA polimerasi).
La capostipite è la TAQ (proveniente dal cappo Thermus aquaticus), che subisce l'inattivazione da caldo ma non la denaturazione: se si raffredda la temperatura è ancora attiva. È in grado di polimerizzare fino a 70 °C ed è stabile fino a 95 °C. Si tratta di una polimerasi veloce e meno accurata della PFU, è quindi preferita in diagnostica e in analitica.
La PFU (Pirococcus Furiosus) è più accurata (ha proof reading che assicura il controllo della polimerazione) anche se meno veloce, utile quindi nella PCR preparativa.