-4° Giorno-
Ligazione del plasmide e trasformazione cellule E. coli

Questo esperimento ha come obbiettivo l'inserimento di un frammento di DNA nel vettore di clonaggio pGEM7Zf. Il frammento porta estremità generate dalla digestione con XbaI e quindi verrà introdotto nel sito XbaI presente nella regione dei Multiple Cloning Sites (Linker)

Protocollo:
Si preparerà una reazione di ligazione utilizzando il vettore pGEM7Zf digerito con XbaI e defosforilato e un frammento di DNA pttenuto da una digestione con il medesimo enzima. Per creare la molecola di DNA ricombinante si userà la DNA ligasi de fago T4. Alla fine della reazione si trasformeranno cellule di Escherichia coli DH5alfa, sensibili all'antibiotico ampicillina.

A disposizione si hanno 3 soluzione di DNA:
- Soluzione1: DNA del vettore digerito con XbaI [concentrazione: 25ng/ul in tampone EB (Tris-HCl 10mM, pH8.5)]
- Soluzione2: DNA del vettore digerito con XbaI e defosforilato con fosfatasi alcalina di gambero [concentrazione 25 ng/ul]
- Soluzione3: Frammento di DNA da clonare risospeso in tampone EB alla concentrazione di 25ng/ul.

Prima di allestire la reazione di ligazione è ooportuno calcolare la quantità di insert da utilizzare. Per avere un rapporto molare tra vettore e inserto di 1:3, utilizzando 50 ng di vettore e considerando che i DNA da inserire è lungo 1.8Kbp, si dovranno utilizzare 90ng di inserto.

• Allestire le reazioni secondo lo schema:
  

  Reazioni	DNA	Tampone diluizione (1X)	Tampone ligazione	Volume Finale	Note
  Vettore linearizzato	2ul	8ul	10ul	20ul	Controllo dell'efficienza di ligazione
  Vettore linearizzato e defosforilato	2ul	8ul	10	20ul	Controllo della defosforilazione
  Vettore defosforilato + frammento (rapporto 1:£)	2 ul + 3.5ul	4.5ul	10ul	20ul	Ligazione vettore-inserto

  
  
• Miscelare su vortex per 2-3 secondi
• Aggiungere 1ul di T4 DNA ligasi e miscelare
• Centrifugare per 2 secondi in microcentrifuga
• Incubare a 25°C per 5minuti.

Protocollo della trasformazione
Questa procedura consente di introdurre DNA in cellule di E.coli. Si testeranno le cellule competenti preparate il giorno precedente utilizzando il plasmide circolare pGEM7Zf, e si useranno cellule competenti già testate e conservate in un congelatore a -80°C in presenza di glicerolo al 10% fino al momento dell'uso.

• Si preparano due provette Eppendorf da 1.5ml sterili e vi si trasferisce 200ul dic ellule competenti preparate precedentemente.
• Aggiungere il DNA seguendo gli schemi riportati:
  

  Schema trasformazione cellule preparate
  Campioni	DNA	Note
  No DNA	-	Controllo Negativo
  Vettore	10ng	Controllo Positivo

  
  
  

  Schema trasformazione cellule testate
  Campioni	DNA	Note
  Vettore linearizzato	Tutta la miscela	Controllo Ligazione
  Vettore linearizzatoe defosforilato	Tutta la miscela	Controllo defosforilazione
  Vettore defosforilato + frammento (rapporto 1:3)	Tutta la miscela	Reazione di ligazione

  
  
• Tenere le cellule in ghiaccio per 20 minuti.
• Sottoporle a schok termico a 42°C per 2 minuti.
• A temperatura ambiente aggiungere 800ul di terreno LB. In questo modo si diluisce la concentrazione di cloruro di calcio permettendo alle cellule di riprendersi ed esprimere i geni necessari alla sucessiva selezione.
• Chiudere e miscelare delicatamente.
• Incubare a 37°C per 40-60 minuti.
• Usare 8 piastre dit erreno solido LB contenente Ampicillina (100ug /ml), X-gal (substrato cromogeno della beta-galattosidasi) e IPTG (induttore del promotore lac che regola l'espressione del'alfa-peptide):
• Con l'ausilio di un ansa sterile si distribuiscono 100 ul (equivalenti a circa 1/10 del volume totale) omogeneamente, sulla superficie del terreno. I rimanenti 9/10 vengono centrifigugati per 1 minuto in microcentrifuga. Si elimina il surnatante e si rispospende il pellet nel terreno rimasto. Le cellule vengono distribuite con un'altra ansa sterile sulla piastra appositamente marcata.
• il controllo a cui non è stato aggiunto il DNA viene centrifugato, il pellet risospeso nel terreno rimasto e piastrato su un'unica piastra.. Allo stesso modo anche il controllo della defosforilazione.
• Le piastre vengono poste per 12 ore a 37°C.

Note, risultati e conclusioni:
Nella ligazione che effettuiamo tra il plasmide pGEM 7Zf e un inserto fornito, osserviamo anche l'attività della fosfatasi alcalina. Questa, infatti, defosforilando gli OH presenti in 3' del plasmide, linearizzato con XbaI non permette che questo dei richiudi su stesso. Reazione di ligasi che avviene con la DNA ligasi del fago T4.

In condizioni di sterilità effettuiamo poi la trasformazione delle cellule rese competenti il giorno prima.
Usando il CaCl2 per rendere competenti le cellule di E. coli abbiamo una efficienza di 106 trasformanti / µg di plasmide. Altre tecniche come l'elettroporazione, permettono di avere efficienza maggiori.
Per piastrare adottiamo questo schema, il quale ci permetterà di osservare i risultati di ligazione e di contare più comodamente le colonie:

 

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