potreste fornirmi una spiegazione dettagliata di come si fa un gel di agarosio? una curiosità, mi ricordo che si deve mettere lo scotch intorno alla vaschetta dv s mette il gel, perchè? e i pettinini quando s mettono, prima o dopo aver colato il gel?
grazie! non ci hanno mai fatto fare un gel per persona ma sempre uno rappresentativo quindi praticamente non l'ho mai fatto e sono un po'in ansia. a cosa dv stare attenta secondo voi?se avete qualche consiglio pliz dispensatemeli!
Attenta che non ci siano bollicine quando coli il gel,in caso puoi spostarle verso il fondo con un puntale,inoltre è importante che la vaschetta sia "in bolla".Quando vai a togliere i pettini,cerca di non muoverli avanti e indietro o sfonderai i pozzetti,inoltre non lasciare i pozzetti vuoti a lungo,tendono a collassare.Sarebbe meglio colare il gel quando è ancora abbastanza caldo,però attenta ai vapori se usi il bromuro d'etidio.
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe."
Io personalmente ti consiglio di mettere i pettinini prima di versare il gel nella vaschetta...Un pò di esercizio e sarà la cosa più banale da fare in lab...
Guarda ho trovato questo: Agarose Gel Preparation è in inglese ma con molte foto che fanno vedere tutti i vari passaggi di preparazione del gel! (Anche lo scotch!)
A parte il fatto che nella prima foto in cui fanno vedere come si mette lo scotch nella vaschetta "vuota", in realtà nella vaschetta si vede che c'è già il gel... va beh... comunque rende l'idea!
Due cose a proposito del gel. L'etidio può essere messo prima di colare il gel nella vaschetta oppure dopo, per evidenziare le bande. A proposito dei pozzetti che si bucano, fare attenzione a come si posizionano i pettini nella parte bassa, nel senso che non vadano a toccare il fondo,lasciate sempre un pò di spazio, altrimenti il gel risulterà bucato.
nel mio caso ce l'hanno fatto mettere nel gel prima di colarlo..tra le altre cose neanche sotto cappa, proprio così all'aria aperta. quando faccio sciogliere il gel nel tampone dv stare attenta a non farlo bollire vero e anche a che non esca dalla beuta così ci hanno detto.. grazie a tutti per l'aiuto, molto gentili!
un'altra cosa, cosa dv aggiungere al mio campione come colorante e perchè lo s fa, solo per avere la tracciabilità durante la corsa?
Devo utilizzare un "loading Buffer" che contenga essenzialmente 2 cose: - un colorante per vedere quello che carichi nel pozzetto e per seguire la corsa elettroforetica - una sostanza che appesantisca il campione in modo che precipiti sul fondo del pozzetto e non esca fuori (in genere Glicerolo o Saccarosio)
Esistono varie formulazioni del buffer una delle più usate è questa:
10 X DNA Loading Buffer
Glycerol 50% Bromphenol Blue 0.4% Xylene Cyanol 0.4%
Ci sono 2 coloranti: Blu di Bromofenolo (blu scuro) e Xilene cianolo (azzurro) che durante la migrazione si separano, vedrai più in alto il blu di Bromofenolo e più in basso lo Xilene cianolo.
tutto giusto, ma ti consiglierei in futuro di usare la cappa chimica quando aggiungi il bromuro e di indossare i guanti per le operazioni successive. PRETENDETE I DPI (DISPOSITIVI DI PROTEZIONE INDIVIDUALI guanti, mascherine, ecc... ), scusatemi ma c'è molta faciloneria per quanto riguarda la sicurezza specie in certi lab universitari, il questi casi come in molti altri la salute è la prima cosa!!!
Concordo pienamente con te zio! Tra l'altro se cerchi nel forum c'è stata una lunga discussione sulle precauzioni e lo smaltimento dell'etidio bromuro!
ciao ........ho pensato di inserirti dei miei appunti di lab per la preparazione del gel di agarosio...... io lo faccio per controllare la pcr,ovvero se si è amplificato il mio target
Leggo spesso di gel d'agarosio colati con il bromuro d'etidio. Nel nostro lab non lo facciamo. Il motivo principale è che lavorando con enzimi che modificano lo stato topologico del Dna il bropmuro d'etidio falserebbe, durante la corsa del Dna nel gel, il risultato. Anche però quando ho a che fare con delle semplici restrizioni enzimatiche non colo mai il gel con EtBr, evitando così di respirarmi i vapori e, soprattutto di sporcare l'apparato per l'elettroforesi. Quindi corro il gel poi lo passo in una vaschetta e aggiungo acqua distillata e EtBR. 20 minuti poi sciaquo altri 20 minuti e faccio la foto. A quel punto l'unica coa a cui stare attenti è lavare bene la vaschetta dopo l'uso. Visto che non l'ho mai fatto prima mi spiegate quale sia l'utilita di colare un gel con già il bromuro d'etidio?(rischaindo di respirarne i vapori e di sporcare più cose contemporaneamente?)
Beh! A parte il fatto che se lo coli sotto cappa non c'è il rischio di respirare i vapori e non sporchi molte cose, solo il "bicchierino" o la beuta in cui lo metti prima di versarlo e il vassoietto del gel. Io personalmente trovo più comodo avere il gel già con l'etidio e preferisco evitare di colorarlo dopo (a parte alcuni casi in cui non posso farne a meno!) perché non mi piace maneggiare soluzioni di etidio, preferisco che l'etidio sia "solidificato" nel gel che non avere una soluzione da smaltire... ma ognuno ha le sue preferenze!!
ERRATA CORRIGE: Scusate... si sono accorta di aver fatto un errore in una risposta precedente...
Citazione:Messaggio inserito da GFPina
Ci sono 2 coloranti: Blu di Bromofenolo (blu scuro) e Xilene cianolo (azzurro) che durante la migrazione si separano, vedrai più in alto il blu di Bromofenolo e più in basso lo Xilene cianolo.
è più in alto lo Xilene cianolo e più in basso il blu di Bromofenolo!!!
Questa è una tabella del peso apparente dei coloranti durante la migrazione in gel di agarosio!
ciao di solito secondo la mia esperienza puoi sciogliere il gel in una beuta e per non farlo fuoriuscire metti del parafilm con dei buchi sull estremità, lo porti ad ebollizione aggiungi l' etidio bromuro (teoricamente sotto cappa) dai una mescolata allabeuta agitandola e veri lentamente il gel nella vascetta precedentemente preparata con lo schotc carta e i pettinini attenta alle bolle che puoi eliminare con un puntale di una pipetta e attenzione alla concentrazione perchè più è concentrato il gel più velocemente devi colarlo
quello che non capisco è il perchè si parli ancora di schotc, beuta con parafilm bucato e di cappe chimiche "teoriche??" e scusami GFpina, ma le slide sono esplicite ma un pò datate Io il gel lo preparo sciogliendo l'agar nel microonde e nelle boccette da 200cc con il tappo a vite, svitandolo un poco durante il riscaldamento facendo attenzione che non fuoriescha durante l'ebollizione. Sovente ne preparo diverse boccette in modo da poterle poi riscioglierle quando mi servono. Il bromuro lo aggiungo non subito (lascio raffreddare per via dei vapori!) prima di versare il gel nel lettino con supporto della BIORAD che non prevede schotc, già in bolla e rigorosamente sotto cappa, lascio raffredare e e non lo uso subito, lo conservo in frigo con qualche ml di tampone sulla superfice.
preparazione di un gel di agarosio
Didattica
Inserito il - 07 giugno 2007 : 19:31:27
Inserito il - 07 giugno 2007 : 19:44:57
tutto giusto, ma ti consiglierei in futuro di usare la cappa chimica quando aggiungi il bromuro
e di indossare i guanti per le operazioni successive.
scusatemi ma c'è molta faciloneria per quanto riguarda la sicurezza specie in certi lab universitari, il questi casi come in molti altri la salute è la prima cosa!!!
PCR.doc
