Mutagenesi Random

La mutagenesi può avvenire:
- tramite sostituzione di basi, su DNA già preformato (il mio gene clonato che viene trattato con mutageni chimici);
- oppure io posso sostituire le basi durante la sintesi del DNA, e questo può avvenire:
. perché determino un’errato accoppiamento delle basi;
. perché faccio incorporare analoghi di basi.

1) Mutageni chimici (DNA preformato):
--> Su DNA ds (double strand)
Acido nitroso.
Agisce sulla Citosina, quindi in funzione della sua concentrazione un po’ di citosine verranno deaminate. Una citosina deaminata diventa un uracile, che durante la sintesi del DNA si appaierà all’Adenina anziché alla Guanosina. Successivamente la U viene eliminata (sistema di riparo che idrolizza le U). Il risultato finale è una transizione CG --> AT.
L’ac, nitroso ha lo stesso effetto sull’Adenina che, deaminata, diventa Ipoxantina che nella synth si appaierà alla C. Il risultato finale è una transizione AT --> GC.
Idrossilammina.
Idrossila la C a T, che si appaierà con la A. Su DNA ss (single strand)
Bisolfito di Sodio.
Il bisolfito deamina la C a Uracile.
Una volta che il mio gene che ho clonato in un certo vettore (M13), questo DNA viene trattato col bisolfito, alla fine ho un insieme random di plasmidi single strand con le U al posto delle C, in varie posizioni, sia sul gene che sul resto del plasmide (ori o amp compresi casualmente).
A questo punto io costruisco un primer complementare ad una certa zona del plasmide (un oligo), se è complemetare si appaia, e se io aggiungo una polimerasi (si suggerisce Klenow che non ha attività eso) e aggiungo pure nucleotidi, la polimerasi sintetizza il secondo strand, cosìcché vengono inserite A tutte le volte che sullo stampo cè la U.
Poi aggiungo la ligasi per chiudere il nick che sarà rimasto alla fine della polimerizzazione da parte della Klenow.
Ora c’è un problema: ho trattato casualmente, quindi è probabile che ori o amp siano danneggiati. Questo mi causa un crollo delle probabilità che il plasmide si replichi naturalmente in E.coli. Per cui excido il gene con enzimi di restrizione (tanto so quali usare, spero che il bisolfito non li abbia toccati e, in ogni caso, non sarò andato a scegliere enzimi con siti di riconoscimento ricchi in GC come Sma, ma userò x es. Hind o Eco).
Una volta che ho exciso questi geni modificati, li riclono sempre in vitro, in un plasmide opportuno tagliato con Hind e Eco, e uso questo plasmide per trasformare E.coli.
Il plasmide verrà introdotto, c’è un sistema di riparo che riconosce le U e le cancella, solo l’altra elica si replicherà, e avrò quindi un mix di plasmidi ricombinanti. Avrò un alto numero di trasformanti, e quindi dovrò avere un veloce sistema di screening.
Nota: il 2° strand lo faccio perché gli enzimi di restrizione sul ss non funzionano.

2) Incorporazione di analoghi.
In questo caso io non ho il mio gene isolato e clonato, ma sto sintetizzando del DNA con le polimerasi opportune. Invece di aggiungere i normali nucleotidi, aggiungo idrossi-citidina-trifosfato (HO–CTP) al posto della C. Questo roba si può appaiare sia alla G, ma anche alla A, se questo succede avrò una transizione CG-->TA.

3) Errato accoppiamento di basi.
L’abbiamo visto un po’ con la PCR: se io faccio avvenire questo tipo di reazione in modo non corretto, usando o concentrazini sbilanciate di nucleotidi, oppure metto Cobalto o Berillio al posto del Magnesio, avrò condizioni che causano erato accoppiamento fra le basi, e quindi errori (anche col manganese).
Posso anche mettere una grande [Mn++]
Posso pure utilizzare enzimi di polimerasi che mancano di attività proof-reading (Taq), e sappiamo che ogni tanto le polimerasi ci infilano un errore. Se faccio un alto numero di cicli la probabilità di ottenere errore aumenta, quindi alla fine avrò del DNA mutagenizzato (sempre casualmente).
Dovrò poi riclonarlo, trasformare ed avere un saggio di selezione.
Il limite è che è difficile ottenere plasmidi con una singola sostituzione: ce ne sono di più e questo aumenta i tempi di analisi di mutanti e il dispendio di energie.

4) Mutagenesi Random Localizzata (Mutagenesi a cassetta).

Ho il mio gene clonato nel plasmide, di cui conosco la mappa di restrizione, ho deciso che devo modificare una certa zona del mio gene, sostituisco questo frammento con una cassetta (coppia di Oligonucleotidi sintetici, che io ho sintetizzato con delle mutazioni). Tolgo il pezzo wild-type ds con tanto di linker e riclono quello che voglio, ottenendo un gene mutante. Trasformo E.coli e seleziono.
Come faccio ad ottenere oligo mutati? Si usano oligonucleotidi drogati:
Gli oligonucleotidi vengono sintetizzati da opportune macchine per cui, viene imposta la sequenza e ci sono 4 boccettine da cui vengono pescati gli (A, T, C, G)TP in giuste concentrazioni. Se nella boccettina delle A io ci metto un po’ di C, la macchina non lo sa, e casualmente pesca. Io posso tra l’altro controllare la frequenza: vedo quanta [C] mettere nella [A]. Faccio la stessa cosa per l’altra elica, ci sarà una certa percentuale di mismatch, e alla fine unisco le 2 eliche. Alcune si appaieranno bene, alcune si appaieranno poco, altre non si appaieranno, avrò quindi una mix di ds di vario tipo. Come al solito devo renderli clonabili, quindi aggiungo ligasi + linker, taglio con gli enzimi opportuni, (il solito discorso di metilazione se non conosco la sequenza e voglio evitare che un’enzima di restrizione mi rompa l’oligo non si pone perché io conosco la sequenza.), clono, trasformo E.coli, seleziono su Ampicillina e avrò un certo n° di cloni, mi metto a sequenziarli tutti, andando a vedere dove ho introdotto le mutazioni, scarterò le wild-type e a seconda del tipo di studio mi sono preposto, sceglierò quale reintrodurre nell’ospite e vedere di nascosto l’effetto che fa.

5) Modifica dei siti di restrizione.
Posso pure modificare (riempire o smangiare) dei siti di restrizione, questo è un modo per introdurre una mutazione. Prendiamo Eco, so che all’interno del mio gene c’è un sito Eco. Taglio con Eco, questo lascia estremità 5’-protruding, posso fare due cose:
- tratto con nucleasi S1, che riconosce i ss e rende blunt,
- oppure col frammento di kleenow posso fare fill in (in funzione delle caratteristiche del frammento di kleenow) che agisce sull’estremità 5’ protruding e riempie (pol 5’-->3’ eso) e quindi introduco delle basi, se poi rilego, ho modificato il mio gene.
Se usare la nucleasi o la kleenow, lo scelgo io, tenendo presente che io introduco mutazioni, ma non voglio mandare tutto fuori frame! Mutagenizzare significa cambiare un aminoacido, non tutto.

6) Inserzioni di linker (linker scanning).
Anche qua modifico le dimensioni del mio gene, le prime volte è stato fatto per studiare i trasposoni. Ho il mio gene, lo clono nel vettore e tratto: in funzione della DNAasi_I che ho posso ottenere tagli random su entrambe le eliche, quindi avrò il plasmide linarizzato in diversi punti. A questa miscela aggiungo ligasi e dei linker, linker che hanno al loro interno un sito di riconoscimento per enzimi di restrizione. Questi si attaccheranno alle estremità delinearizzate, che hanno estremità diverse. aggiungo i linker, dopodiché devo tagliare con Eco, in modo da avere estremità compatibili. Riaggiungo ligasi in modo da ricircolare i plasmidi.
Siccome i tagli sono stati random, e quindi avrò una miscela di plasmidi linearizzati in diversi punti, io aggiuso le condix di taglio in modo tale che ciascun plasmide sia tagliato in media solo una volta. I miei linker sono introdotti in diversi punti del mio plasmide. Avrò una mix di plasmidi con inserito random il mio sito Eco. (questo sempre in vitro). Trasformo E.coli, in quei plasmidi in cui la mutazione permette comunque la replicazione, ne avrò un certo numero, io ho inserito Eco, posso usare Eco e fare la mappa di restrizione per vedere dove il sito Eco si è inserito, e scegliere quindi quelli che presumibilmente hanno inserito all’interno del gene in una zona di mio interesse, senza dover sequenziare tutta la baracca.

7) Bal_31 e Eso_III
Questi enzimi possono creare una delezioni bidirezionali, l’altra solamente da una parte sola.
Ricordiamo che Bal31 dipende dal Calcio, come prima reazione smangiava, poi si metteva a bluntare. Abbiam detto attività Eso, sia su estremità 3’ e 5’ sia blunt che protruding.
Allora, io ho il mio gene clonato nel plasmide, in questo caso è un gene della sub.tà 5S del RNA ribosomale. Taglio con un enzima di restrizione. Mi interessa, del gene che ho isolato, studiare, x es., la zona in 5’. Taglio il sito unico e si linearizza. aggiungo la Bal31 col Calcio, questo comincia a smangiare, ma io a diversi tempi fermo la reazione e prelevo delle aliquote. Bal31, a differenza della Eso3, smangia in tutti e due i sensi, (smangia il mio gene ma anche il plasmide).
As un certo punto la mia mix avrà estremità blunt, questo vuol dire che posso aggiungo dei linker con siti di restrizione, sempre con la ligasi (rendo clonabili le estremità). Tuttavia, siccome ha smangiato il mio gene, ma ha smangiato anche il plasmide, può essere che sia andata a toccare q.che sito sacro come Amp o Ori, percui devo estrarre il mio gene dal vecchio plasmide tagliando con il secondo enzima che isola il mio gene e inserirlo in un plasmide nuovo.
Con questo vado a trasformare E.coli, selezionerò per ampicillina, estraggo il plasmide dai E.coli cresciuti, sequenzierò e quindi andrò a trasformare l’ospite originario, vedendo cosa succede.
In genere questo tipo di analisi è usato per modificare la regione 5’ del gene, quindi le zone promotori. io voglio vedere se la zona 5’ è capace di indurre trascrizione, e fino a che base questo fa quello che deve fare, e se ci sono enhancer o se ci sono silencer.
Idem se mi interessa la fine: taglierò il 3’ e farò questo tipo di analisi.
Si preferisce Eso_III, perché ha la stessa attività exo 3’-->5’, ma agisce solo su estremità 5’ protruding o blunt ma non agisce su estremità 3’ che posso quindi proteggere (quella sul plasmide).
Come farò a proteggere? Faccio il primo taglio con con BamH1, che lascia estremità 5’ protruding, taglio poi con un sito adiacente Sti che lascia estremità 3’ protruding, aggiungo Eso3, questo smangia solo a partire dall’estremità 5’, solo in un senso. Eso3 non è un enzima che blunta, quindi il procedimento da seguire è lo stesso (prelievo di aliquote a tempi diversi), ma alla fine, per aggiungo i linker, io devo bluntare! C’è l’S1 che taglia i ss. Aggiungendola avrò varie miscele di delezioni in un solo senso. Ora devo richiudere, ma ho un estremità blunt da una parte e un estremità Psti, allora, o decido di bluntare Psti o aggiungo un linker Psti all’estremità blunt. Siccome Psti è 3’ non si usa la Kleenow (non filla le 3’ protruding).
Ora richiudo, ho il plasmide perfettamente funzionante, trasformo, etc.

Uso PCR per la mutagenesi casuale

Condizione di amplificazione in cui si verifica con una frequenza opportuna, mutazioni di inserimento delle basi. Non ci interessa dove la PCR venga sbagliata, ci basta che ogni tanto metta delle mutazioni. Andremo poi a vedere gli effetti. Non ci servono troppe mutazioni: lo studio di una mutazione è impegnativo… Queste tecniche sono basate sul fatto che in certe condizioni l’enzima sbaglia l’incorporazione delle basi.
Polimerasi prive di attività di proof reading (che non controllano cioè l’accuratezza dell’appaiamento dell’ultima base) come Taq e derivate.
Alta [Mg++] anche una base incorporata in modo sbagliato, a concentrazione salina opportuna, riesce a stare abbastanza prossima al templato senza distorcere troppo la struttura della doppia elica.
[dNTP] sbilanciata: quello abbondante di alcuni ordini di grandezza (non basta il doppio) verrà introdotto al posto degli altri.
T annealing < Tm. Oltre ad inserire basi sbagliate facciamo annilare anche l’opposto sbagliato: la mutazione estrema.
Alta forza ionica, dipende dalla [ ]tot di ioni presenti, vale lo stesso discorso del Mg++.

Le tecniche di mutagenesi viste fin d’ora non necessitano di grandi informazioni sulla sequenza da mutagenizzare, sono quindi un tipo di mutagenesi che uno fa come prima analisi, perché mi danno informazioni preliminari. Successivamente si passa alla mutagenesi sito diretta.