Con questa tecnica non agisco a fondo con lo screening, ma sulla sua costruzione.
Le banche a cDNA sottrattive sono arricchite di cloni di messaggeri presenti specificatamente in una determinata popolazione cellulare (linea +) rispetto ad una popolax cellulare che presumibilmente non li contiene (linea –).
Il cDNA totale preparato dalla linea (+) viene cimentato con la popolazione di mRNA totale della linea (–) in una reazione di ibridazione in liquido.
Ogni mRNA troverà il suo cDNA e vi si appaierà formando una doppia elica, mentre alcuni cDNA della linea (+) non troveranno alcun mRNA complementare, e potranno essere separati attraverso il passaggio in una colonna cromatografica di idrossiapatite, che trattiene differenzialmente gli acidi nucleici a singola e a doppia elica, rallentando il volume di eluizione di quest'ultima (che quindi rimarra in colonna).
Con le molecole di ss cDNA (+) separate si costruisce una banca a cDNA.
In dettaglio:
- Estraggo gli mRNA totali,
- Aggiungo trascrittasi inversa, sintesi del 1° strand con formazione di elica duplex RNA-cDNA.
- Tratto con la soda (NaOH) per denaturare,
- Elimino l’RNA che ho usato come stampo (RNAasi A, perchè idrolizza dall’inizio dove devo togliere).
- Metto ad associare i cDNA ss con gli RNA estratte dall’altro tipo de cellule.
I messaggeri, e quindi i geni in comune, mi danno ibridazione. Otterrò ibridi, cDNA non ibridati e mRNA non ibridati. Adesso mi interessa il cDNA non ibridato, ci sono colonne di idrossiapatite in grado di legare i duplex, l’RNA ma non i cDNA ss. Quindi, passaggio su colonna e nell’eluato ho i cDNA specifici delle cellule del primo ceppo. Visto che ho solo quelli, parto con la banca. Ho il 1° strand, faccio il secondo per poterlo clonare.
Un esempio: ho clonato il gene per il recettore delle T-cells, è un messaggero molto raro espresso solo in certe condizioni.
Il punto di partenza sono i 2 ceppi: B-cells e T-cells, i quali avranno sì dei messaggeri in comune, ma non tutti. Il recettore, so che è in PM, quindi estraggo RNA, trascrittasi inversa, duplex, RNA stampo, cDNA, rimuovo RNA, ho i ss dei cDNA di tutti i messaggeri dei T-cells. aggiungo un eccesso di tRNA estratti da B-cells, si assoceranno. Colonna, eluisco solo i cDNA specifici dei linfociti T, faccio il 2° strand (polimerasi, trattamento con S1 x’ devo eliminare il loop ss, e come clonaggio uso la Terminal Transferasi che mette un po’ di code, ora clono in un vettore che abbia estremità compatibili). Ho trasformato, ho la mia genoteca. Ora faccio lo screening con una sonda radioattiva di cDNA specifico per le cellule T. Sonda fatta in questo modo:
T-cells, ho isolato l’RNA collegati alle membrane (sul RE), sicché il recettore è associato alla PM. Uso degli anticorpi contro la proteina e riesco ad immunoprecipitare il tutto polisomico, quindi arricchisco (nel polisoma c’è sia il mRNA che la proteina) di messaggero specifico contro il recettore (o contro la proteina X). Ho arricchito, trascrittasi inversa, aggiungo un nucleotide* in modo da avere tutti i cDNA*, –> ho il duplex mRNA/cDNA*, elimino l’RNA, ho i ss di cDNA* (arricchito) e con questo costruisco una sonda specifica per il recettore, faccio lo screening e in questo modo è stato isolato il gene. Poi ovviamente è stato sequenziato eccetera. In realtà mi troverò X cloni positivi, poi sta a me…

Clonaggio dei geni per rodopsina.

Coinvolta nel processo visivo e localizzata nei bastoncelli, è presente sia nell’uomo che nella mucca che nella drosophila e così via.
Ho cominciato dai bovini. Polisomi, ho anticorpi, immunoprecipito, ho arricchito per mRNA di rodopsina. Arrivo a costruire la genoteca in tutti i modi che più mi garbano: posso metilare se ci metto dei linker, mentre in questo caso è il clonaggio in lambda, avrò placche, caratterizzo, ho il DNA da screenare: se avevo l’anticorpo vuol dire che avevo la proteina, sequenzio, sintetizzo l’RNA complemetare considerando la degenerazione del codice. O, costruisco tutti quelli possibili: decido quella che è usata più spesso e faccio la sonda con quella.
Gli oligo che mi son fatto lo metto assieme all’RNA arricchito che avevo isolato all’inizio. Faccio l’annealing, gli oligo si appaiono se c’è omologia, metto trascrittasi inversa e un nucleotide marcato in alfa, uso l’oligo come primer della sintesi 5’–>3’. Denaturo, elimino l’RNA e screeno sulla banca. Avrò X cloni, sequenzio, bla bla bla.
Ho isolato questo dai bovini, ma lo voglio anche dalla drosofila. Presumibilmente i geni sono omologhi, quindi l’amplificato posso usarlo come sonda per lo screening.
Ma in drosofila usando la sonda del cDNA non ci riesco: nessun segnale positivo dai cloni.
Strategia alternativa: prendo il cDNA e lo rendo clonabile in un plasmide pGEM faccio trascrizione in vitro di questa sonda specifica (gene* isolato dai bovini) lo metto a contatto con l’RNA isolato dalle teste delle drosofile. Avrò ibridazione, perché se c’è omologia si avrà appaiamento. Colonna di idrossiapatite e in questo caso (in condizioni opportune) faccio legare solo i duplex e poi li eluisco da soli. Denaturo. Avevo 2 RNA, uno dei quali arrivava da dei messaggeri e quindi aveva le sue codine. Quello che ho fatto con la trascrizione in vitro invece no. quindi avrò un 2 duplex uno con RNA-codato. E sai che faccio? Aggiungo poliT che si appaierà soltanto all’RNA codato, quello che arriva dalla drosofila. Trascrizione inversa, 1° strand di DNA, bla, bla, bla,…, isolamento, clonaggio. Et voilà!.

Abbiam parlato di banche (genomica, cDNA) che presupponevano uno screening mediato da sonde (RNA, DNA).
Ammettiamo di avere solo l’anticorpo. L’unico mezzo che ho per screenare la banca sono gli antibodies… e quindi su una banca ad espressione.