Eravamo rimasti a costruzione di banche (genomiche o cDNA) e di sonde necessarie per poter fare lo screening o di colonie o di placche (sonde a DNA, sonde a RNA, sonde marcate su entrambi i filamenti, su uno solo, alle estremità, eccetera). Le sonde servono per screenare la banca, ma quando si fanno digestioni parziali per avere frammenti di geni con zone di sovrapposizione fra di loro (per cromosome walking) e screeno non avrò un clone positivo, ma avrò N cloni positivi. Allora estraggo il DNA di tutti i positivi e faccio la mappa di restrizione: devo caratterizzarli, perché poterbbero essere tutti uguali, oppure diversi o in parte sovrapposti.

La mappa mi dà già un’indicazione di che cloni sono: se hanno successione di siti uguali potrebbero essere sovrapposti. Per avere una indicazione sui frammenti posso anche utilizzare sonda. Infatti se ho un gene in tre frammenti, ognuno dei quali in un plasmide in E.coli, se uso tutto il gene come sonda ottengo tutti i cloni positivi.Posso anche usare una sonda non per tutto il gene, ma per una parte. Sul mio DNA estratto uso come sonda solo una parte del gene. In base alla sonda che uso spostandomi sul cromosoma, e lavorando parallelamente con le mappe di restrizione, io riesco a stabilire le zone di overlapping ed anche a stabilire l’ordine.
L’altra funzione della sonda è che può essere usata sia in esperimenti di Southern (DNA) che di Northern (RNA). In quella ad RNA oltre a dirmi i ceppi di messaggero mi dice anche il senso di trascrizione: usando sonde a DNA si ibrideranno lo stesso ma non so quale dei due filamenti della sonda di DNA ha ibridato. Sia le sonde ad RNA che quelle a DNA possono essere utilizzate su DNA genomico separato mediante Southern, perché sia che ci sia 1 strand (RNA) che 2 (DNA) ibrideranno comunque.
Lo scopo di usare e screenare con sonde in esperimenti di Southern è per sapere se il gene che cerco è presente. Una volta saputo che c’è, e una volta che ho isolato il gene X di cui ho fatto la mappa di restrizione, posso usarla per costruire la mappa sul genoma, e la mappa genomica deve rispecchiare quello che ho già trovato. In questo modo:
DNA genomico –> serie di digestioni: singole, doppie, triple e così via. –> Uso una sonda che su tutto il digerito ibridi in modo “specifico” con quel frammento.
Questa è la digestione totale con Eco (E) e Hind (H).

Siti restrizione: H  E             E               E              E    H
Gene X:            ?––?–––([[[[[[[[[?[[[[[[[[[[[[[[[?[[[[[[[[[|––––?––––?
                 ^____________________________________^   
                   GeneX

Ho il gene X con x siti all’interno e all’esterno, ad distanze.
Taglio con Eco, smearing, sonda. Utilizzo tutto il gene. Se ho tagliato con Eco, dei tre frammenti riconosce tutti e tre, quindi tre bande con tot peso, quindi tot distanza.
Digerisco con un altro enzima Hind, definisco l’ordine.
Posso giocare con le dimensioni della sonda, così non riconoscerà le bande esterne sia su Dig(E) che su Dig(H). Se non riconosce q.cosa mi dà informazioni sull’ordine. Costruisco la banda genomica se non è successo q.cosa, come la perdita di un sito dovuta a metilazione accidentale.
Con lo stesso principio, oltre che al genomico, le sonde possono essere usate sui singoli cromosomi, X è su 13? separo i cromosomi (PFGE, FACS) e guardo dove ibrida.