Utilizzando un anticorpo devo screenare una proteina. devo quindi mettermi in condizioni tali per cui il DNA venga espresso e tradotto. Non mi interessa che la proteina sia attiva. Non è un saggio di attività, ma di presenza.
Il vettore usato è lambda, e nel caso particolare lgt11, (o pBlue-Script). La zona di clonaggio è tutto il gene lacZ con il suo promotore, che evidentemente regola l'espressione. Rendo clonabili o il DNA o il cDNA (a seconda dell'estrazione) e li clono nell'ultimo codone del gene lacZ, in C-term.
Se ho dsDNA può entrare così sia in un verso che nell'altro. Poichè a me interessano solo quelli che entrano in un modo, (perché la proteina va fatta), avrò una corretta sintesi nel 50% dei casi.
Inoltre esiste pure un frame di lettura da rispettare: se vado a clonare il gene X con le sue basi, solamente in condizioni frame avrò una proteina: deve esserci il consenso di traduzione. Freq.: 1/3.
Freq. finale: 1/2 . 1/3 = 1/6.
Per ogni singolo gene solo 1/6 mi darà una proteina ibrida con beta-Gal.
Ma posso essermi perso un sacco di cose: se Eco taglia bene, bene. altrimenti male. Però io faccio le digestioni parziali, frammenti con overlapping. Fa niente se non clono tutto il gene in continuo.
Le faccio ibride perché si è visto che in E.coli queste sopo più stabili.

Si chiamano banca di espressione, perché prima avevamo visto banche genomiche e banche a cdna e lo screening relativo con diversi tipi di sonde, sonde comunque a RNA o a DNA, ma alcune volte, diceva, può esserci un problema: l'unica cosa disponibile è l'anticorpo, che può quindi essere usato per individuare cloni positivi in una banca ad espressione.

Queste banche, rispetto alle altre, impongono delle ulteriori difficoltà:
1. nelle genomiche e nei cDNA non avevo bisogno di espressione e di traduzione, mi bastava avere un frammento del gene, invece in questo caso io devo avere un prodotto polipeptidico (non necessariamente funzionale) che io devo rilevare con l'anticorpo, quindi vuol dire che il gene non solo dev'esserci, ma dev'essere trascritto e dev'essere tradotto. E questo succede se ci sono le condizione adatte, le banche di espressione sono in E.coli, e l'origine è molteplice ma in maggior parte geni eucarioti (presenza introni) e E.coli non fa splicing(in quantonè un procariote), quindi anche in questo caso devo passare per cDNA. Posso avere genomi con pochi introni, quindi posso partire dal genoma, genoma che io tratto facendo digestioni parziali. In entrambi i casi, per questa banca come per le altre devo  fare in modo che sia più rappresentativa possibile dell'intero genoma.

2. La seconda complicazione è la necessità di avere trascrizione e traduzione. Sono in E.coli, per la trascrizione mi serve un promotore e segnali di terminazione, e per avere un efficiente trascrizione userò promotori dell'organismo ospite (coli), perché se metto promotori che derivano dall'origine, ho pochissime probabilità che funzionino. Stesso ragionamento per i segnali di terminazione.  Con i cDNA non ce n'eravamo preocupati. Inoltre il trascritto deve essere il più stabile possibile. e poi devo pure tradurre, quindi condizioni appropriate. La proteina deve esserci e deve essere stabile. Si è visto che in genere sono più stabili se sono proteine ibridate con proteine di E.coli: la presenza di una porzione proteica originaria di E.coli rende il prodotto polipeptidico più stabile e meno sottoposto a degradazione. Inoltre, sto facendo una proteina, quindi a seconda del promotore avrò + o meno trascritto e quindi più o meno proteina. Non è detto che questo proteina non faccia male a E.coli!  Introduco nell'organismo qualcosa di estraneo (e di tossico), quindi si usano in genere promotori inducibili: così da poter decidere quando fare la proteina. Per le banche di espressione si usano molto spesso come vettore di clonaggio il fago lambda GT11. Del quale sappiam già che struttura ha ecc. ecc. Le estremità cos, geni per la lisi, geni per la replicax ecc. e  ha al suo interno il gene lacZ di E.coli intero, con tanto di promotore. I frammenti che ho originato (o i cDNA) vengono clonati nell'ultimo codone del gene lacZ, quindi il tutto è sotto controllo dell'inducibile promotore lacZ. La banca dev'essere più rappresentativa possibile, ma siccome il sito di clonaggio è fatto in Eco, i miei frammenti avranno estremità Eco, le possibilità di clonaggio saranno nei 2 sensi  e in più io dovrò avere una proteina ibrida, quindi la fusione dovrà essere in frame: sii deve ripristinare tutta la lettura a triplette senza la presenza di segnali di terminax, fino alla fine. La tripletta sono 3 basi, quindi avrò come probabilità 1/3 di frame su tutti i geni. Inoltre la fusione in frame può cmq cambiare gli aa (casualità).
I ricombinanti con proteine di fusione saranno un po' meno rispetto ai ricombinanti di una banca a cDNA o una banca genomica, per tutti questi limiti.

Per fare una banca di espressione:
- Ho il genoma di lambda, tagliato con Eco,
- aggiungo i frammenti genomici e cDNA con estremità Eco,
- ligazione e formazione dei concatameri,
- impaccamento in vitro con teste e code, terminasi che taglia nei siti cos, formazione dei fagi.
- infetto E.coli lacZ negativo,
- non induco, faccio lisare e raccolgo tutti i fagi ricombinanti (questo perché voglio eliminare prodotti tossici: devo avere tutto)
- raccolgo la genoteca, la titolo (da tot fagi ottengo tot ricombinanti), e la conservo.
Il passo successivo è lo screening, dal titolo, faccio avvenire un'infezione in presenza di IPTG. Parte la trascrizione e la successiva traduzione --> polipep ibrido.
Trasferisco su nitrocellulosa le placche ricche di proteine e i film di nitro vengono immunodecorati con  l'anticorpo specifico contro la proteina x. L'immunodecorazione è analoga a quella di una westhern blot. Avrò (spero) più segnali positivi.

Clonaggio della RNApol_II di lievito.
Con questo sistema è stata clonata la RNA pol_II di lievito e il punto con cui si sono originati i frammenti è diversa: meccanico o digestione parziale, metilazione dei siti, aggiungo linker, aggiungo lambda trattato con fosfatasi, metilazione, impaccamento in vitro --> fagi.
Infetto E.coli lacZ negativo e altre caratteristiche: se infetto un ceppo col repressore lacZ non è espresso, quindi lacI non serve. C'è una mutazione che sopprime una mutazione, riportando in condizione di funzionamento. Il fago ha un gene mutato per la lisi, e non lisa, se infetto un E.coli che ha un prodotto in grado di sopprimere questa mutazione, ha complementazione e il prodotto finale è funzionante. Se infetto questo ceppo avrò lisi, altri ceppi no. Questo perché in alcuni casi mi servono i fagi integrati. Non è questo caso. labda gt11 è un po' simile a lambda, ma non è uguale (ha il gene s mutato e altra roba). qn pipettando ho tutto lo stock di fagi, un po' li metto via e un po' li uso per scrinare un ceppo di E.coli che è quello che uso per lo screening della banca, questo E.coli ha lo stesso genotipo ma in più ha un 'altra mutazione delta long, mutazione a carico delle proteasi: il ceppo non ha questa proteasi, così non rompe i cglni alla proteina ibrida. L'infezione è fatta in presenza di IPTG (indux gratùita) e nonostante sia lacI la trascrix parte. ho la lisi, le proteine sono poco degradate e ho le mie placche che trasferisco su filtro di nitrocellulosa che metto a contatto con l'anticorpo. Come rilevo il legame antigene-anticorpo? O l'anticorpo è marcato di suo, o uso un sistema successivo in grado di riconoscere l'anticorpo, emettere un segnale e, possibilmente, amplificarlo. Per rilevare posso usare la radioattività o la colorimetria o la fluorescenza, decido quello che preferisco. In genere ua volta si usava la proteina la proteina iodinata A125, era in grado di legarsi alla GG degli ab, e lasciava un segnale sulla lastra fotografica.
Screening. Ovviamente ho sia il controllo positivo che il controllo negativo dell'ab. e per ovviare posso fare uno pseudoscreening: infetto il E.coli e induco, lambda non ha fatto la proteina di fusione, placche, l'ab riconosce q.cosa specifico di E.coli e non di lambda e io avrò il legame. Tengo il resto della soluzione, quello che non si è legato. (???).
SMETTIAMOLA DI RAGIONARE I TERMINI ASSOLUTI BIANCO NERO: io arricchisco: cerco di migliorare. il segnale può essere più o meno debole, ecco perché elimino quello che mi dà uno pseudo-segnale!. Ho la lastra, devo risalire al filtro e quindi alla piastra, ecco perché devo segnare tuti i passaggi. so che sulla piastra l'area di lisi corrisponde la fago che i ineressa. Con la punta blu della gilson a stantuffo vado sopra il segnale e tiro su un pezzettino di agar, isolato dal resto. Ora centrifugo e tratto chimicamente per eliminare l'agar, otterrò una soluzione con il mio fago presunto positivo. Con questa soluzione riinfetto di nuovo E.coli, induco IPTG, e screening, perché se quello è pulito, tutte le placche devono dare segnale positivo adesso. Se non è così magari era un falso positivo. E ripeto ad libitum fino a che, piastrando 10³ fagi, ottengo tutti (99%) segnali positivi. Se ne ho di meno scarto. Ora estraggo il dna dal fago, perché devo fare la mappa di restrizione e mi aspetto di trovare in N-term il gene lacZ e in C-term il mio frammento x e, per ultimo un pezzettino di lacZ. La mappa di lambda ce l'ho, faccio la mappa di restrizione. Potrei già avere un'idea dalle dimensioni (ho isolato il gene intero o un pezzo?) ma di più non so, e se sono partito da una digestione parziale, non è che questa sia una grande info.
Ora ho la mappa, che faccio? posso sequenziare e vedere dove trovo gli stop: se ho clonato 2 geni contigui (?.). Con il sequenziamento qualche idea ce l'ho, vado a vedere anche la proteina ibrida però. estraggo le proteine (sds-page) prima guardo le proteine totali (blu coomassie) e controllo positivo (induzione) e negativo (non induzione). In entrambe le 2 condizioni §è finita la cassetta§.
La beta gal è un tetramero con ogni catena da 114 kDa, in condizioni denaturanti vedo una sola banda 114, la proteina ibrida deve pesare di più (114 + x) e siccome ne viene fatta tanta, devo poterla vedere già in coomassie. Anche perché è l'unica banda in più, quindi con tutta probabilità (mai certezza) quella è la mia proteina. Per la certezza uso l'anticorpo: blotto il filtro e westhern con il mio ab. Se riconosce in modo specifico siamo a posto.
Se io faccio legare l'ab a questa proteina recomb, butto via quello che non si lega, stacco l'anticorpo (eluizione) e lo riuso per fare una westhern sulla proteina originale contro cui avevo fatto l'anticorpo (quella originaria che avevo iniettato nel coniglio e di cui volevo conoscere il gene, sì proprio quella, quella che avevo trovato per strada sola soletta e che, mi ero promesso, gli avrei trovato il suo gene, lasciamo stare monoclonale o policlonale) così col cazzo che ho i falsi positivi. (cmq dipende sempre in che banda si trova il positivo., ma i falsi positivi pullulano).
 → Ora ho isolato un frammento del gene. E lo uso per andare a screenare una banca a cDNA o genomica, dove ho molte più possibilità di riuscire a isolare il gene intero. Un bel progresso, considerando che all'inizio avevo solo una proteina catarrosa.
Inoltre, dal peso che dimostra di avere la banda 114+x, e usando il peso medio degli aa, posso risalire a grandi linee da quante basi è composto il pezzo di gene.