Quando la faccio devo passare attraverso messaggeri, questo dipende dalle condizioni del tessuto e del trattamento: posso avere influenzato la trascrizione di certi geni. Potrei trovarmi nelle condizioni in cui trovo un numero elevato di certi messaggeri, ed altri espressi molto poco. Se devo identificare questi ultimi partendo da banche a cDNA globali, l’isolamento è molto difficile: devo screenare un sacco di cloni per una cosa che alla fine è poco rappresentata.
Tuttavia esistono dei metodi che permettono di cercare cose poco espresse o espresse solamente in certi momenti (in seguito a trattamenti con farmaci per esempio)come lo screening differenziale o banca a cDNA sottrattiva.

Screening differenziale

Per capire praticamente questa tecnica, facciamo un esempio sulla carbossilasi che deriva dalle foglie di pisello, una proteina molto grossa costituita da 8 subunità grandi (55 kDa) tutte uguali e da 8 subunità piccole tutte uguali (14kDa). Abbiamo 2 geni, uno per la subunità grande nel cromosoma genomico e uno per la piccola, presente nel cloroplasto. Sono geni espressi in seguito al trattamento alla luce. Ammettiamo di essere interessati a clonare uno di questi. Innanzitutto devo verificare che, in seguito all’esposizione della luce questi vengano espressi. Come si fa? Estraggo i messaggeri da piante di pisello cresciute al buio e da piante cresciute alla luce. Posso vedere se c’è l’espressione preferenziale di qualcosa o attraverso delle Northern, o facendo la traduzione in vitro verificando il suo risultato con anticorpi specifici. Alla fine vedo che l’espressione preferenziale c’è.
Dagli acidi nucleici , attraverso la trascrittasi inversa ottengo il cDNA: prima un solo strand e con una polimerasi posso fare il secondo strand (usando l'RNAasi H per eliminare poi gli ibridi, ed ancora polimerasi per fare il secondo filamento di DNA), il risultato è cDNA double strand. Poi lo rendo clonabile, e trasformo E.coli. Le piastre vengono trasferite in doppio su nitrocellulosa (per ogni piastra ho due repliche identiche). I due filtri identici li ibrido con 2 sonde diverse, una con RNA* (marcato) che deriva da piantine cresciute alla luce, l’altra con RNA* che deriva da piantine cresciute al buio. Ho dei segnali. Ci saranno messaggeri comuni che segnalano in entrambi, messaggeri espressi solo al buio e altri espressi solo alla luce. A me interessano quelli espressi solo in presenza di luce: dalla nitrocellulosa “luce” escludo quelli comuni e prelevo quelli “luce”. Devo verificare, perché il falso positivo è molto frequente.
Ripiastro di nuovo, sempre colonie singole, riibrido, e posso ibridare con una sonda che deriva dal messaggero arricchito per questo gene:
Per l'arricchimento della sonda per un gene parto dall’analisi di northern per vedere se un certo messaggero è espresso ottenendo una certa banda di un certo peso molecolare, oppure faccio una westhern e vedo una proteina che, splicing a parte, mi permette di risalire al peso del messagggero. Ora ho in modo indicativo le dimensioni del messaggero, ora, da tutti i messaggeri (“luce”) che ho estratto, posso decidere di fare una separazione in base alla dimensione (size selection).

L’altro modo per avere dei cDNA di mRNA poco espressi, non agisce sullo screening, ma sulla costruzione della banca: Banche a cDNA sottrattive.