Precursori (dNTP)
Devono essere bilanciati, perché se ce n'è uno in concentrazione
limitanti l'enzima o incorpora qualcos'altro o si ferma. Ovviamente
contano anche la lunghezza: 500 bp necessitano di una concentrazione
di dNTP minore di una sequenza di 5000 bp, così come di n°
di cicli di reazione. Ricordiamo che negli ultimi cicli la quantità
di templato polimerizzata è molto elevata.
Oligo
- Prodotti in vitro per sintesi chimica, non sono ammesse preparazioni
non pure per quanto riguarda la composizione in basi, o l'ampli
non sarà specifica.
- Questo significa anche limitarsi ad un range di dimensioni da
18 a 30 nt, dopodiché il rischio di non precisione e il costo dell'oligo
li rende non adatti per la PCR.
- Non devono essere limitanti ma non devono essere nemmeno in eccesso
(aumenta il rischio di dimerizzazione).
- La coppia di oligo deve avere temperature di denaturazione simili
(Tm1~Tm2).
Scelta della Tm
Più la Tm (temperatura di fusione, quella per la denaturazione
del DNA) è alta e più aumenta la probabilità che gli oligo si appaiano
specificatamente, quindi quelli completamente omologhi al templato.
La Tm si calcola con formule empiriche.
· Ad una costante fissa viene aggiungo un contributo positivo che
deriva dalla ricchezza in GC dell'oligo (maggior contributo alla
stabilità) e aggiungo un contributo negativo: oligo molto corti
hanno in proporzione meno interazioni fra le basi e quindi tenderanno
a staccarsi dal templato a temperature più basse. Questo è l'algoritmo
correntemente utilizzato.
· C'è poi il caso particolare nel calcolo della Tm per gli oligo
che non sono completamente omologhi soprattutto nelle regioni centrali:
un non omologo all'estremità può essere, per assunto, solo l'appaiato.
Ma se la zona non omologa si trova al centro l'assunzione non si
può fare: per trovare la Tm esiste una formula (che ha una diversa
costante fissa) che tiene conto del contributo negativo della parte
non appaiata (% di mismatch).
· Non deve verificarsi self annealing: i due oligo non devono appaiarsi
fra loro, altrimenti la concentrazione di oligo effettiva nella
miscela di reazione si abbassa notevolmente. Non solo, se l'appaiamento
è solo fra le code queste si distendono ed avremo eterodimeri di
oligo, la polimerasi polimerizzerà un oligo, ed ai cicli successivi
si appaieranno altri oligo e, alla fine, troveremo piccole molecole
(100 bp circa) che sono state ottenute da una sequenza in tandem
di oligo. Questa miscela sottrae attività enzimatica, sottrae oligo,
nucleotidi e quindi riduce notevolemnte l'efficienza d'amplificazione.
In particolare non si devono anilare in corrispondenza del 3', è
ovvio, perché è qui che comincia la polimerizzazione e, se si annilano
qui, l'allungamento è compromesso.
· La sequenza non deve permettere formazioni di stem loop.
· L'appaiamento col templato deve essere stabile, quindi valuto
1. Il grado di purezza delle preparazioni (i detergenti
destabilizzano l'anniling) se so che il materiale non è purificabile
quello che si fa è allungare l'oligo e sceglierlo in maniera tale
che sia il più univoco possibile;
2. La temperatura di annealing
· Se nella sequenza dell'oligo c'è un sito dei restrizione, non
è detto che debba appaiarsi (oligo con le ali) ho la comodità che,
una volta fatta l'amplificazione, posso tagliare a quel livello
e introdurre direttamente nel plasmide.
Esistono software per la scelta dei primer:
OLIGO
SOFTWARE: Oligo Analyzer 1.0 e Oligo Explorer 1.0 (da installare)
OLIGO
CALCULATOR (on line)
WEB
PRIMER (on line)
Mg++
Non deve essere limitante: tutto ciò che metabolizza
polimeri di nucleotidi necessita di Mg++.
Se è largamente eccedente determina inaccuratezza, aumentando la
frequenza degli appaiamenti degli oligo con sequenza non omologhe:
le 2 cariche positive possono interagire con i fosfati e dare stabilità
all'appaiamento. Stabilizzando gli omologhi, stabilizzano anche
i non omologhi, e questo va evitato.
La [Mg++] ottimale si determina tenendo conto che può essere legato
sui fosfati di DNA ds, Oligo e dNTP; sommando queste concentrazioni
(conto stechiometrico/spannometrico) più la [compatibile] con l'attività
enzimatica. Si va a spanne: si guarda l'ordine di grandezza molare.
Equipaggiamento
Oggi esistono termociclatori automatizzati che permettono
di impostare il ciclo e fanno tutto loro con tutti i cambi di temperatura.
Purtroppo tra di loro sono soggetti a variabilità, è meglio quindi
che in un laboratorio ci siano termociclatori dello stesso modello.
È conveniente usare sempre lo stesso tipo di provette per tenere
costane l'inerzia termica della provetta.
Se abbiamo allestito una PCR
in condizioni non ottimali.
.quello che succede è che uno degli oligo si appaia in una
zona non desiderata. L'appaiamento scorretto porta ad un abbondante
presenza di un amplificato di dimensioni scorrette. (Non è che gli
appaiamenti scorretti siano rilevabili solo dopo tanti cicli di
reazione: se si verificano si verificano dall'inizio, quindi non
è vero che facendo 40 cicli piuttosto che 20 si aumenta la probabilità
di osservare fenomeno. È chiaro che, per una questa di frequenza
sarebbe vero, ma la proporzione è così bassa che il caso sporadico
è poco rappresentato).
Il principale problema della tecnica di PCR è la contaminazione
da prodotti di amplificazioni precedenti che può causare amplificazione
di DNA parassita (falsi positivi)
COME SOPPRIMERE LE CONTAMINAZIONI
1. Precauzioni.
PCR in stanze separate dalle altre operazioni, vetreria dedicata
solo a PCR, massima sterilità.
2. Hot Star PCR
Ovvero PCR con partenza a caldo, si tratta di aggiungere
la Taq velocemente subito dopo il primo lungo step di denaturazione.
Lo stratagemma ha lo scopo di aumentare la specificità dell'annealing
elongato.
3. Nested PCR
Si tratta di realizzare due PCR successive utilizzando coppie di
primers differenti, con la seconda che inquadra una sequenza inclusa
in quella amplificata dalla prima coppia.
Se la prima amplificazione è artefattuale, nella seconda i primers
non si appaieranno!
In questo modo aumento:
- Specificità
- Tasso di amplificazione
4. dUTP + UNG.
Amplifico fornendo dUTP anziché dTTP
Dopo l'amplificazione lavo la provetta con UNG quindi con una scaldata
denaturo UNG.
Uso la provetta priva di DNA per un altro ciclo di reazione con
un nuovo templato.
CLONAGGIO DEI PRODOTTI DI PCR.
Abbiam visto che è possibile inserire negli oligonucleotidi dei
siti di restrizione, che comodità:
sample 1) amplifico -> digerisco
sample 2) digerisco il plasmide
sample 3) mix sample 1) & 2) and aggiungo ligase.
Ora trasformo.
L'estremità degli amplificati è un'altra caratteristica che differenzia
Taq e Pfu:
· Taq molto spesso lascia delle basi
in più sull'elica 3' come single strand. Spesso sono delle A (o
T). Sistemi in commercio sfruttano questo A per farle legare in
plasmidi in cui sono stati messe delle poli-A.
· Pfu produce amplificati blunt,
quindi o usiamo plasmidi blunt o usiamo la terminal transferasi.
Allestiamo una reazione in cui mettiamo soltanto delle A, ed otteniamo
un amplificato Pfu con la coda di poli-A, che a questo punto può
essere clonata in un plasmide commerciale che presenta la coda di
poli-T.
Clonaggio di DNA di organismi non coltivabili.
Mettiamo di partire da DNA genomico digerito con un enzima, quindi
una soluzione estremamente eterogenea di frammenti di cui conosciamo
però le estremità (derivanti dall'enzima di restrizione usato).
Essendo eterogenea non possiamo decidere a priori quali oligo usare
per amplificare tutti i frammenti che abbiamo: perché non bastano
le basi del sito di restrizione (4-10) per costruire l'oligo. Come
si fa? Possiamo fare una ligazione a livello delle estremità (che
conosciamo) e alla ligazione attacchiamo una coda (o linker) di
cui conosciamo tutta la sequenza perché l'abbiam sintetizzato in
vitro.
È su quel linker che andremo a costruire gli oligonucleotidi complementari,
e siam pronti per fare la PCR. Arriviamo alla fine con molecole
di questo tipo: il frammento centrale a sequenza sconosciuta, più
coda esterna con sito di restrizione, che abbiamo avuto la cura
di ricostruire completamente, e altre basi. Ora ridigeriamo con
l'enzima di partenza (quello con cui avevamo tagliato il templato
all'inizio) otteniamo un amplificato che è già pronto per essere
riclonato in un plasmide che porti la sequenza per l'enzima che
abbiamo usato all'inizio. Rispetto agli altri metodi, questo ha
un passaggio in più: la ligazione iniziale. Come tutte le cose,
non avremo un'efficienza del 100%, ma la tecnica è usata frequentemente
quando dobbiamo ottenere dei frammenti da un templato limitante.
Riassumendo:
· fill in con Kleenow + T4 polinucleotide kinasi + ATP
· oligo con le ali, dove le ali sono siti di restrizione.
→ I cloni ottenuti devono essere
per accertarsi che la DNApol non abbia mutato la sequenza originale.
