La tecnologia del DNA ricombinante si basa sul fatto che qualsiasi frammento di DNA proveniente da qualsivoglia organismo puo' essere inserito in un vettore molecolare batterico.
Nie batteri questi vettori vengono amplificati per fornire grandi quantita' di DNA; gl'inserti, a questo punto, possono essere studiati a mio avviso, in molti modi.
Alla fine degli anni 70 e anni 80 sono ste messe a punto tecniche che permettono l'introduzione di mutazioni puntiformi,delezioni ed inserzioni in segmenti di DNA clonato e l'alterazione di specifiche coppie di basi.
Abbiamo reso possibile molti esperimenti introducendo mutazioni specifiche in segmenti di dna predeterminati.
I metodi che servono a programmare alterazioni specifiche di geni sono la mutageneni sito-specifica e la sintesi di geni.
La procedura per le mutagenesi sito-specifiche si serve di piccoli oligonucleotidi, lunghi approssimativamente 15-25 coppie di basi, in vitro..
Il gene viene clonato in un vettore fagico a singolo filamento, come M13.
L'oligonucleotide sinteticoviene utilizzato come premier per la sintesi in vitro del filamento complementare del vettore M13.Si possono introdurre nelle sequenze del premier tutte le sostituzioni che si vogliono e anche se cisara' una base non appaiata quando l'oligonucleotide ibrida con la sequenzaq complementare sul vettore M13,uno o due errori possono essere tollerati quando l'ibridazione si realizza a abassa temperatura ed a aalta concentrazione di sale.
Si fa' avvenire la replicazione in vitro con DNA polimerasi e quindi si fa' replicare M13  in escherikia coli.
Ne risulteranno parecchi fagi portatori della mutazione desiderata.
Si puo' usare lo stesso nucleotide , radioattivamente marcato, che si e' usato come primer , come sonda per identificare i fagi mutati mediante ibridazione.
Questo metodo viene poi usato per produrre un soppressore di amber (UAG) da un tRNA umano convertendo l'anticodone in una sequenza che riconosce la tripletta UAG invece della tripletta AAA (lisina). Il tRNA inserisce una lisina in risposta al codone UAG.


Federico Cesareo

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