INTERFERENZA GENICA MEDIATA DA siRNA.

Una tecnica,che merita particolare attenzione, e che è stata introdotta solo di recente, è quella che permette di interferire con l’espressione di alcuni geni dannosi mediante la trasfezione di piccoli frammenti di RNA a doppio filamento in grado di antagonizzare l’RNA messaggero corrispondente (“ RNA INTERFERENCE”).

La tecnologia dell’RNAi è basata su un processo di inattivazione genica post-trascrizionale, altamente specifico, presente in piante e animali, innescato da RNA a doppia elica (dsRNA) omologo alla sequenza del gene da sopprimere.E’ stato evidenziato che in natura la cellula necessita di questo tipo di soppressione genica post-trascrizionale per combattere eventuali infezioni causate da virus dotati di genoma a dsRNA, o da microrganismi patogeni in grado di produrre dsRNA durante il loro ciclo replicativo.La scoperta è recente ed è avvenuta grazie a studi condotti su Caenorhabditis elegans, un nematode riscontrabile soprattutto nel suolo e comune in tutto il mondo.
E’ stato possibile indurre RNAi in C. elegans in tre modi relativamente semplici:

a) attraverso l’iniezione di dsRNA nelle gonadi dei vermi

b) immergendo i vermi in una soluzione di dsRNA (soaking method)

c) attraverso la somministrazione ai vermi di batteri contenenti plasmidi in grado di produrre dsRNA.

Il dsRNA somministrato attraverso una qualsiasi di queste vie ha la capacità di propagarsi da cellula a cellula e di indurre un’interferenza di tipo sistemico.
In seguito a tali esperimenti la tecnica è stata poi usata con successo anche in piante,Drosophila e in altri nematodi.Al contrario,il suo utilizzo inizialmente non è stato possibile per cellule di mammifero nelle quali il dsRNA può innescare una serie di reazioni a catena che portano a degradazione aspecifica di mRNAs.Oggigiorno gli esperimenti condotti per provocare l’interferenza mirata possono avvenire in cellule di diversi organismi e si avvalgono dell’utilizzo di sequenze di circa 20bp. Sequenze più lunghe,infatti,provocherebbero una generale distruzione di tutto l’mRNMA cellulare,nonché stimolerebbero la produzione di IFNgamma,una citochina proinfiammatoria rilasciata in caso di infezione virale. Selezionata la sequenza ottimale si procede alla trasfezione cellulare facendo ricorso ad uno dei tre metodi maggiormente utilizzati:

- Trasfezione diretta con RNAds

- Trasfezione di un plasmide contenente due sequenze che codificano per il senso e l’antisenso dell’RNA che si vuole produrre(o due plasmidi ciascuno con una sequenza).
Una volta trasfettata,la cellula produrrà i due strand dell’RNA che si uniranno a formare RNAds.

- Trasfezione con un plasmide contenente una sequenza che codifica per uno shRNA (small hairpin RNA),cioè un RNA unico che contiene la sequenza senso,uno spacer (5-6 basi)e la sequenza antisenso.Questo RNA avrà una struttura a “forcina”,poiché il senso e l’antisenso si uniranno.

I mediatori della degradazione specifica degli mRNA sono dei frammenti di 21-22 nucleotidi di “small interfering RNA”(siRNA)generati dal taglio di dsRNA più lunghi ad opera di un enzima dimerico denominato Dicer.Studi recenti indicano che questi piccoli frammenti di dsRNA di 21 nucleotidi sono in grado di sopprimere in modo specifico l’espressione di geni endogeni ed eterologhi in diverse linee cellulari di mammifero.

MODELLO PROPOSTO DA ZAMORE.
Zamore e colleghi hanno proposto un modello per il meccanismo dell’RNA interference basandosi su studi finalizzati al chiarimento del ruolo dell’ATP nelle varie tappe della reazione.Secondo questo modello la reazione dell’RNAi procede attraverso almeno quattro steps sequenziali:

1) Il processamento del dsRNA (ATP-dipendente)

2) L’incorporazione degli siRNAs in un complesso inattivo da circa 360 kDa (ATP-indipendente)

3) Lo svolgimento del siRNA duplex (ATP-dipendente)

4)Il riconoscimento e taglio dell’RNA (entrambi ATP- indipendenti)

PRIMO STEP:PRODUZIONE DEGLI siRNAs

L’enzima responsabile della prima reazione dell’RNA interference,il processamento dell’RNA a doppio filamento in piccoli RNA a doppio filamento di 21-23 nucleotidi con estremità sporgenti al 3’,è stato identificato di recente dal gruppo di E.Bernstein.
I ricercatori,partendo dall’evidenza che il taglio del dsRNA produce piccoli RNA duplex che hanno le caratteristiche tipiche dei prodotti delle reazioni catalizzate dalle RNasi III,hanno condotto una ricerca nei genomi di Drosophila e Caenorabditis di geni codificanti per proteine contenenti uno o più domini di tipo RNasi III e hanno così individuato una famiglia genica,la famiglia CG4792,i cui membri contengono due motivi RNasici di tipo III e un dominio elicasico ammino-terminale.Per verificare il coinvolgimento del gene CG4792(in Drosophila)nella reazione di taglio caratteristica del primo step dell’RNAi questa è stata la procedura:



1) CG4792,fuso con l’epitopo di T7, è stato fatto esprimere in cellule S2;

2) Sono state isolate le proteine ibride per immunoprecipitazione con anticorpi anti-T7;

3) E’ stata verificata la loro capacità di produrre dsRNA di 22 nucleotidi se messi in presenza di lunghi dsRNA.

Risultato: CG4792 dava test positivo con qualunque sequenza di RNA a doppio filamento.Gli autori hanno chiamato la proteina CG4792 “Dicer” (letteralmente in italiano significa “produttore di cubetti” )perché si dimostra in grado di digerire dsRNA lunghi in piccoli dsRNA di taglia uniforme (circa 22nt). Ogni membro della famiglia Dicer contiene:

- un dominio NH2-terminale ATP-dipendente
- RNA elicasi,
- dominio PAZ,tramite cui forma un complesso con Argonaute2
-motivi tandem RNase III like
- dominio COOH-terminale dsRNA-binding

Dicer agisce solo contro RNA a doppio filamento ed è meno attivo con i substrati più corti(circa 200bp).Probabilmente le preferenze di substrato di Dicer determinano la dipendenza dell’RNA interference dalla grandezza del dsRNA.Gli immunoprecipitati di Dicer-1 richiedono ATP per produrre sequenze di 22 bp e tale richiesta può indicare che sia necessario il distacco degli RNA guida dal dominio elicasico perché l’enzima agisca cataliticamente.Gli esperimenti di Zamore con siRNAs sintetici hanno rivelato la richiesta di un 5’ fosfato sul filamento del siRNA complementare all’ RNA target e una richiesta parziale di fosforilazione al 5’ del filamento del siRNA che ha la stessa sequenza dell’RNA target:è stato proposto che il 5’ fosfato sul siRNA serva come punto di riferimento molecolare dal quale viene misurato il sito di taglio.Difatti si è visto che nucleotidi addizionali alle estremità 3’ del siRNA non alterano il sito di taglio sull’RNA target,ma nucleotidi addizionali al 5’ spostano corrispondentemente il sito di taglio.

SECONDO STEP:FORMAZIONE DEL COMPLESSO INATTIVO (siRNP)

E’ stato proposto che gli siRNA si leghino a specifiche proteine indirizzandole verso il pathway dell’RNA interference.Nei lisati di embrioni di Drosophila,la maggioranza degli siRNAs viene incorporata in un complesso di circa 360 kDa,che gli autori hanno chiamato siRNP (siRNA/protein complex).Sebbene questo complesso non sia competente per il taglio dell’RNA target,sembra probabile che si tratti di un intermedio nel pathway dell’RNAi,poiché non si forma con siRNA che,mancando di un fosfato al 5’,non mediano RNA interference.

TERZO STEP:CONVERSIONE IN COMPLESSO ATTIVO (RISC)
Secondo il modello di Zamore,la conversione del complesso inattivo da circa 360 kDa in un complesso attivo,RISC (circa 230 kDa),avviene in un secondo step dipendente dall’ATP che prevede lo svolgimento del duplex siRNA da parte di una RNA elicasi.La dimostrazione dell’esistenza di un secondo step ATP dipendente nella reazione dell’RNA interference viene dall’osservazione che in presenza di siRNAs nativi e ATP nel lisato,l’RNA target viene rapidamente degradato (ATP+).Mentre si osserva solo degradazione non specifica in assenza di ATP (ATP-).Questi risultati indicano l’esistenza di una seconda tappa dipendente dall’ATP successiva al processamento del dsRNA nel primo step dell’RNA interference.
RISC effettua attività di taglio (sia eso-che endonucleasico),di svolgimento e di ricerca (scorrimento) ed è lecito pensare che queste attività siano svolte da altrettanti componenti o domini del complesso.
L’elevata efficienza e specificità dell’RNAi nel trovare l’mRNA target risiede nella capacità di RISC di analizzare gli mRNA e di individuare il suo target specifico definito dalla sequenza di 21/22 nucleotidi complementare,azione svolta da un dominio ad attività progressiva di scorrimento che ha omologie di sequenza con la famiglia delle proteine RecA,proteine implicate nel riconoscimento di sequenze omologhe di DNA nella ricombinazione.Infine,una componente proteica del complesso RISC,grazie alla interazione del suo dominio Paz con quello dell’enzima Dicer,sembra essere il ponte tra questi due complessi enzimatici nel consentire il passaggio dei siRNA;ciò è stato evidenziato tramite immunoprecipitazione con una versione epitopetichettata della proteina Dicer da cellule S2 trasfettate.

QUARTO STEP:RICONOSCIMENTO E TAGLIO DEL TARGET

Il complesso formato da siRNA e proteine è in grado di riconoscere e tagliare il suo RNA target specifico anche in assenza di ATP e altri cofattori.Questo aspetto è stato chiarito dal gruppo di Zamore in questo modo:

1)Un dsRNA è stato incubato con lisato e ATP in una reazione standard di RNAi

2)Il complesso siRNA/proteine è stato precipitato con ammonio solfato

3)Il precipitato,risolubilizzato,è stato dializzato per rimuovere piccole molecole(cofattori)e quindi trattato con esochinasi e glucosio per un’ulteriore deplezione di ATP

Si osserva che sia in presenza che in assenza di ATP il taglio del target è specifico.

MODELLO PROPOSTO DA LIPARDI.
Un aspetto rimarchevole del processo dell’RNAi è che l’induzione locale del silenziamento genico può espandersi in tutto l’ organismo e spesso può essere ereditata dalla successiva generazione; questo è stato dimostrato nelle piante e in C. elegans. Inoltre, solo poche molecole di dsRNA per cellula o embrione silenziano completamente il gene corrispondente, un risultato che porta a ipotizzare che in natura il processo potrebbe essere catalitico. Studi genetici in Neurospora, Arabidopsis e C.elegans hanno identificato diversi geni coinvolti in RNAi : oltre a elicasi, RNasi III (Dicer e correlati) e membri della famiglia Argonaute, questi includono una RNA polimerasi RNA dipendente (RdRP).
Supportati da queste evidenze, Lipardi e collaboratori, dimostrano l’esistenza di un meccanismo che differisce da quello proposto da Zamore per spiegare il silenziamento genico da parte del macchinario dell’RNAi.

L’ RNAi viene innescata da una concentrazione soglia di dsRNA. Lunghe sequenze di RNA a doppia elica vengono immediatamente tagliate da enzimi della famiglia delle RNasi III,generando in tal modo duplex siRNA. I duplex vengono convertiti in RNA a filamento singolo da un’attività elicasica. A questo punto il modello si differenzia dal precedente.
Infatti, è stato proposto che gli siRNA a singolo filamento interagiscano con l’mRNA target a loro complementare come primer, consentendo la formazione di RNA lunghi a doppio filamento ad opera dell’attività polimerasica di una RdRP. Ci sono tre modi in cui questo può avvenire:
• siRNA primers si allineano in maniera casuale (cioè in varie posizioni ) lungo il filamento templato, uno per templato, e vengono estesi dalla RdRP per formare dsRNA;
• siRNA multipli si allineano lungo un singolo filamento templato vengono poi estesi dalla RdRP fino al siRNA adiacente. I prodotti di estensione sarebbero ligati da una RNA ligasi putativa (non c’è tuttavia evidenza genetica del coinvolgimento di RNA ligasi nell’ RNAi);
• dsRNAs si formerebbero mediante un meccanismo di primer "guida",con cui gli siRNAs si allineerebbero lungo il templato per ligazioni successive. Questo meccanismo risulta essere indipendente da RdRP.
Tutti questi meccanismi possono generare dsRNA di lunghezza sufficiente per essere tagliati dall’ attività di Dicer (che richiede un minimo di 39bp) che, in questo modo, degrada l’mRNA e nello stesso tempo genera nuovi siRNAs.
In sostanza, quindi,il modello propone che cicli ripetuti di sintesi di dsRNA e concomitante produzione di siRNA/primer portino alla degradazione dell’mRNA target. In questo modo,l’mRNA viene degradato attraverso un ciclo di "PCR degradativa".
Prove a favore del modello
E’ stato osservato che l’attività di degradazione di un corrispondente mRNA richiede la presenza sugli siRNA di un ossidrile al 3’. Questa richiesta indica che gli siRNA potrebbero servire da primers per un’attività RdRP nell’RNAi. Se questo fosse corretto, l’ incorporazione di siRNAs marcati dipenderebbe in maniera specifica dall’uso di RNA templati complementari. In accordo con il ruolo come primer per RdPR, gli siRNA vengono incorporati specificamente in
RNA fullsize per tutti i templati. Non si osservano combinazioni eterologhe RNA/siRNA nè combinazioni DNA/siRNA. La lunghezza degli siRNA potrebbe essere importante per la loro funzione: la conservazione della taglia, in tutte le specie finora esaminate, dei piccoli RNA associati con il silenziamento potrebbe essere strettamente correlata con la loro funzione di primer.
La dimostrazione chiave del modello viene dal fatto che l’RNA che ha incorporato siRNA marcato risulta essere a doppio filamento. Per dimostrare questo, gli autori digeriscono i prodotti di reazione con RNasi I: questi prodotti si rivelano resistenti alla digestione con nucleasi in condizioni che degradano completamente un ssRNA di controllo. Per cui, gli RNA marcati con siRNA sono a doppia elica.
Gli RNA marcati con siRNA, a questo punto, potrebbero essere i substrati di taglio di enzimi come Dicer. Per testare questo, l’RNA full-lenght è stato purificato e incubato in estratti.
L’ RNA marcato con siRNA viene processato per produrre nuovi siRNA. Questo fenomeno è stato osservato anche quando la reazione precedente di incorporazione di siRNAs veniva incubata per tempi lunghi: si aveva degradazione del dsRNA e accumulo degli siRNAs.






APPROCCI TERAPEUTICI INNOVATIVI
Numerosi ricercatori stanno attualmente analizzando i vantaggi offerti da questa nuova classe di silenziatori genici costituita dai piccoli frammenti di RNA di interferenza. Queste molecole rappresentano infatti dei potenti strumenti di ricerca e, soprattutto, dei potenziali agenti terapeutici.


INIBIZIONE DELLA PROTEINA AQP4.
In ambito terapeutico è stata dimostrata la sua efficacia nel trattamento alternativo per la cura di edemi cerebrali.
Interessanti risultati sono stati infatti ottenuti utilizzando la tecnica dell’RNAi per inibire l’espressione di alcune proteine come l’AQP4, abbondantemente espressa nel cervello,principalmente a livello degli astrociti. Poichè la sua espressione è fortemente polarizzata a livello dei processi perivascolari,il suo ruolo potrebbe essere legato ai fenomeni di osmoregolazione e di omeostasi idrica che si verificano nel cervello.E’ ormai noto che l’AQP4 è legata alla formazione ed allo sviluppo della barriera emato-encefalica,è coinvolta nella Distrofia Muscolare di Duchenne e nella formazione dell’edema cerebrale.
Indagini abbastanza recenti effettuate su topi knock-out (KO) per il gene dell’AQP4,mostrano che questi topi danno una migliore risposta,in termini di sopravvivenza,dei topi wild-type,in un modello di edema cerebrale causato da intossicazione acuta con acqua. Poichè i farmaci utilizzati per la cura dell’edema cerebrale sono gli stessi da ormai 60 anni,questi esperimenti su topi KO aprono una nuova prospettiva rappresentata dall’inibizione specifica dell’AQP4 come approccio terapeutico per ridurre la formazione di edema in diversi disordini cerebrali.
E’ stato ultimamente dimostrato che colture primarie di astrociti possono essere utilizzate come modello sperimentale per lo studio del ruolo fisio-patologico della AQP4 in quanto la proteina è qui funzionalmente attiva ed espressa abbondantemente.Proprio a causa dell’assenza di inibitori specifici dell’AQP4,è stata utilizzata la recentissima tecnologia dell’interferenza dell’RNA (RNAi) al fine di inibire l’espressione dell’AQP4 in colture primarie di astrociti e valutare gli effetti biochimici,morfo-funzionali e di alterazione genica che questa inibizione determina.






PRINCIPALI RISULTATI

La tecnica dell’RNAi è in grado di sopprimere in modo altamente specifico l’espressione di AQP4 in colture primarie di astrociti di ratto.


Per determinare l’efficienza e la specificità della tecnica di silenziamento genico,grazie ad un’analisi di Western blot, sono stati valutati i livelli di concentrazione della proteina AQP4 due,quattro e sei giorni dopo un singolo iniziale trattamento con RNAi. I risultati dimostrano che i livelli della proteina son stati progressivamente ridotti fino a che,dopo sei giorni,il trattamento con RNAi ha provocato un’inibizione massima del 77,9%.

AQP4 knockdown (AQP4-KD) induce negli astrociti un’alterazione delle proprietà di trasporto dell’acqua.
I risultati dimostrano che il silenziamento del gene AQP4 provoca un’alterazione delle proprietà di trasporto dell’acqua nella membrana plasmatica degli astrociti. Difatti,la permeabilità osmotica di astrociti trattati con siRNA per l’AQP4 si riduce di circa il 50% rispetto a quello degli astrociti trattati con un siRNA di controllo.

AQP4 knockdown induce un’alterazione nella morfologia e nella crescita degli astrociti.


La soppressione del gene dell’AQP4 determina profonde variazioni nella morfologia degli astrociti in coltura i quali si trasformano da astrociti caratterizzati da una forma più tozza e poligonale (fibrosi) ,in astrociti caratterizzati dalla presenza di numerosissimi sottili prolungamenti (protoplasmatici).Il fenotipo associato alla soppressione dell’AQP4,caratterizzato dalla trasformazione di astrociti dalla forma poligonale in astrociti dalla forma stellata,potrebbe essere spiegato con una
trasformazione della cellula per aumentare il rapporto superficie/volume,quale estremo tentativo per incrementare gli scambi idrici e compensare l’assenza dell’AQP4.


Sebbene sia improbabile che l’RNAi possa essere utilizzato come un efficace rimedio farmaceutico in grado di bloccare tempestivamente la mutazione dell’astrocita,gli studi condotti sull’inibizione di AQP4 grazie a RNAi in animali risulteranno utili per avvalorare l’ipotesi che l’inibizione dell’attività di AQP4 rappresenta un potenziale obiettivo per il trattamento dell’edema cerebrale.

CONCLUSIONI

L’affascinante tecnica dell’ RNA interference ,che prevede l’utilizzo di piccoli interruttori (molecole di siRNA) capaci di interferire con l’attività di un gene, rallentandola, acquista una notevole importanza in campo biotecnologico. La tecnica, utilizzata dai ricercatori per studiare le funzioni e le caratteristiche di specifici geni, potrebbe inoltre avere un impatto decisivo sul fronte terapeutico. Controllando infatti il lavoro di un gene si può pensare di contrastare malattie infettive prodotte da virus o patologie dipendenti da un gene alterato.

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