1. INTRODUZIONE
1.1 INSUFFICIENZA RENALE ACUTA (ARF).

L’insufficienza renale è una patologia sempre più diffusa, che spesso complica il decorso di altre malattie quali il diabete e le malattie cardiovascolari portando ad una mortalità ospedaliera del 30-80%.
Chi soffre d’insufficienza renale, nelle fasi iniziali, spesso può non accorgersi della malattia finché non cessa la funzione dei reni ed è necessario sottoporsi a terapie come la dialisi o il trapianto.
Quando la perdita di funzione si realizza in pochi giorni o settimane, si parla di Insufficienza renale acuta: di solito la condizione è grave ma se s’identifica la causa e la si cura opportunamente è reversibile in 2-4 settimane. L’ARF è associata ad una necrosi tubulare acuta scaturita da una prolungata ipo-perfusione renale e da una prolungata ischemia renale o da sostanze nefrotossiche (es. mioglobina o emoglobina), che portano alla morte delle cellule tubulari. Il recupero delle funzioni renali dipende, quindi, dalla sostituzione delle cellule tubulari necrotiche con cellule epiteliali tubulari funzionanti.
L’assenza o la riduzione della rigenerazione dell’epitelio e dell’endotelio predispone alla malattia renale cronica.
Nonostante miglioramenti nelle terapie di sostituzione renale, nessun trattamento è al momento disponibile, e di conseguenza la mortalità dei pazienti affetti da ARF è ancora alta, circa il 50%; perciò è importante trovare una terapia potente che diminuisca la mortalità da ARF, migliorando la capacità di riparare il danno tubulare.

1.2 UTILIZZO DI CELLULE STAMINALI NELLA RIPARAZIONE DEL DANNO TUBULARE.

Le due caratteristiche principali per definire le cellule staminali sono:
La loro capacità di auto rinnovarsi estensivamente;
La loro potenzialità di differenziarsi in più tipi cellulari.

In ogni discorso sulle cellule staminali è importante definire prima il tipo di cellula    staminale e la loro origine.
Le Cellule staminali emopoietiche (HSC) sono cellule in grado di autoriprodursi e di dare vita ad altre linee cellulari dalle quali, in seguito ad un processo di maturazione e differenziazione, derivano tutte le cellule del sangue: globuli rossi, globuli bianchi e piastrine. Le cellule staminali emopoietiche sono localizzate principalmente nel midollo osseo, ma è possibile reperirle anche nel sangue circolante. Per quanto riguarda l’ARF, l’utilizzo delle HSC non ha dato buoni risultati: ad esempio,1 l’iniezione di Lin– c-kitPOS  HSC non è riuscita a proteggere i topi trattati con cisplatin da danno tubulare. HSC sparsi sono stati rilevati marcando le strutture tubulari dei topi per il cromosoma  Y dopo l'iniezione di HSC maschili, indicando che le HSC possono localizzarsi nel tessuto renale danneggiato, tuttavia, queste sono molto meno numerose rispetto alle MSC.
Le Cellule staminali mesenchimali (MSC)  sono capaci di autoriprodursi, come pure di differenziare in molti tessuti “mesenchimal-derivati”: infatti si sviluppano come cellule aderenti nella coltura e danno origine, sia in vivo che in vitro, a osteoblasti, condroblasti e  adipociti una volta esposte agli stimoli adatti. Risiedono nel midollo osseo ma recentemente sono state isolate cellule staminali anche in altri tessuti (SNC, retina, muscolo scheletrico, etc.), e si è visto che si differenziano preferenzialmente nelle stesse cellule del tessuto di origine, ma possono anche dar vita ad altre linee embrionali .
La possibilità che le MSC possano contribuire alla rigenerazione del tubulo danneggiato nell’ARF è ancora materia di discussione, ma in tal senso ci sono degli studi in cui si dimostra 2la presenza di cellule col cromosoma Y in reni femminili trapiantati in pazienti maschi, suggerendo che le MSC sono migrate nel rene e qui si sono differenziate, anche se in piccola percentuale. 3Poulsom & et al. affermano che le MSC possono contribuire alla rigenerazione dell’epitelio del tubulo renale. Infine, molti studi confermano un effettivo coinvolgimento delle MSC nella riparazione dell’epitelio tubulare con il ruolo di supportare i fattori di crescita nello stimolare le cellule staminali residenti a proliferare e differenziarsi, e di limitare le reazioni pro-infiammatorie del tessuto intorno a quello danneggiato.

2. METODOLOGIA    
2.1 ISOLAMENTO E CRESCITA DELLE MSC DAL MIDOLLO OSSEO.

8Per isolare le MSC si sacrifica un topo GFP transgenico femmina di 8 settimane e si prelevano il femore e la tibia separandole dal muscolo e dal tessuto connettivo. Le estremità degli ossi sono rimosse e il midollo viene prelevato introducendo un ago di calibro 21 nella colonna dell’osso e riempiendola con 1mml di Eagle’s medium contenente 10% FCS, 0.01 M di EDTA, 100µg/ml di streptomicina e 100 unità/ml di penicillina. Il midollo spinale, così raccolto, viene filtrato attraverso un filtro di 75 µm e le cellule piastrate in plastica con una densità di 20-40x106 cellule per 9.5 cm2 in α-MEM contenente: 10% FCS, 10% di siero equino, 2mM di L-glutammina, 100unità/ml di pennicillina e 100 µg/ml di streptomicina. Dopo 72 ore il sulnatante è eliminato e le cellule aderite sono invece lavate con terreno nuovo, dopo di che sono tenute in coltura per 1-3 settimane. A questo punto, le cellule sono staccate con 0.25% di tripsina contenente 50mM di EDTA per 5min a temperatura ambiente.

2.2 CARATTERIZZAZIONE DELLE MSC.

Per capire se ciò che è stato piastrato è veramente MSC si valuta l’espressione in superficie di markers e citocheratine attraverso l’analisi citofluorimetrica.
Sono perciò utilizzati i seguenti Anticorpi primari monoclonali anti-mouse: anti-CD44, anti-CD105, anti-CD29, anti-CD73, anti-CD14 (recettore liposaccaridico), anti-CD34, anti-CD45, e anti-pan-citocheratina. Le cellule sono staccate usando EDTA 0.05M e incubate con BSA 1% in PBS per bloccare i siti non specifici. Le cellule, sospese in 100µl di staining buffer , sono poi incubate con gli anticorpi specifici per 30 min e in fine con PE goat anti-rat IgG e PE goat anti-mouse IgG per 20 min. Tutte le incubazioni sono effettuate in stainig buffer a 4 °C, e le cellule sono lavate due volte tra le incubazioni.
L’analisi è effettuata utilizzando il “FACSCalibur cytometer”: sono acquisiti 10,000 eventi  per ogni analisi, effettuata con il CellQuest software. Una piccola percentuale di cellule, 0.01%, sono cresciute come fibroblasti dando colonie 5-7 giorni dopo l’iniezione

Dopo 15 giorni dall’iniezione, invece, dall’analisi dell’espressione di antigeni di superfici, si vedono popolazioni a singolo fenotipo.
Al 1^ e 2^ passaggio, rimuovendole con o senza tripsina,  le cellule sono uniformemente positive per CD105, CD73,CD29,CD44, ma anche negative ai markers emopoietici, inclusi i recettori polisaccaridici CD14 e CD34, e i comuni antigeni leucocitari.

2.3. ISOLAMENTO, ESPANSIONE E DIFFERENZIAZIONE DELLE CELLULE PROGENITRICI RENALI CD133.

2Le cellule renali progenitrici sono prelevate dalla porzione corticale del rene. Dopo la dissezione e il passaggio attraverso una graduale serie di maglie, le cellule CD133 sono isolate dalla porzione tubulare attraverso la cattura magnetica delle cellule, usando il sistema MACS. Fatto ciò le cellule vengono piastrate su fibronectina in presenza di medium.
Per il clonaggio, le cellule sono depositate singolarmente in piastre da 96 pozzetti e facendole crescere in presenza di FGF (fibroblast growth factor) si differenziano in epiteliali. La differenziazione in cellule endoteliali si ottiene unendo terreno EBM medium, fattore di crescita endoteliale vascolare e 10%  di siero fetale bovino.

3. MODELLI MURINI
3.1 MODELLO MURINO D’ INSUFFICIENZA RENALE ACUTA.

Per valutare l’abilità delle MSC di localizzarsi nel rene danneggiato, si sono utilizzati topi C57/BL6 in cui è stato indotto un danno tubulare acuto con un’iniezione intra-muscolare di glicerolo.
I topi sono stati anestetizzati con isoflurano e iniettati con glicerolo al 50% in acqua, 3,75 ml/kg per ogni muscolo delle gambe anteriori. Il glicerolo induce miolisi ed emolisi esponendo il tessuto, specialmente quello renale, ad una quota massiccia di mioglobina ed emoglobina che portano ad alterazioni morfologiche dell’epitelio tubulare quale vacuolizzazione ed estesa necrosi del tubulo  prossimale e distale che perde, inoltre, i bordi a spazzola . Dopo 1-4 giorni dalla somministrazione di glicerolo si osserva un aumento dei livelli sierici di creatinina , che raggiungono il massimo al 3^giorno, diminuiscono al 10^giorno e si normalizzano a 21.

3.2 XENOGRAFT IN TOPI SCID.

Le cellule progenitrici CD133 sono impiantati sotto-cute nei topi SCID con il Matrigel. Le cellule sono raccolte usando tripsina e l’acido etildiamintetracetico , raccolte e risospese in Dulbecco’s modified Eagle’s medium . Le cellule sono poste in ghiaccio, aggiunte a 250 µl di Matrigel a 4°C e iniettate nel fianco sinistro dei topi SCID. Il decimo giorno i topi sono stati sacrificati e il matrigel è stato analizzato.

4.RISULTATI
4.1 LA SOMMINISTRAZIONE DI MSC-GFP+ PROMUOVE LA RICOSTRUZIONE DELL’EPITELIO TUBULARE.

Iniettando endovena 1x106  di MSC ai topi GFP transgenici in cui è stato indotto il danno tubulare acuto, si vede al 3^, 5^, 8^ e 10^ giorno una riduzione dei livelli sierici di creatinina rispetto ai controlli in cui è stato somministrata soluzione salina

Rispetto ai danni indotti dal glicerolo precedentemente elencati, somministrando le MSC-GFP+ si notano delle lesioni meno gravi del tubulo al giorno 5  rispetto al controllo che non le ha ricevute,  mentre al giorno 8 dall’iniezione del glicerolo, le lesioni persistono con un aumento dell’ atrofia dell’epitelio tubulare, l’istologia del rene dei topi trattati con le MSC è significativamente migliorata.

4.2 MSC-GFP+ DIFFERENZIANO IN VIVO IN CELLULE DELL’EPITELIO DEL TUBULO RENALE.

La localizzazione  e la morfologia delle MSC-GFP+  suggerisce la loro integrazione nell’epitelio tubulare. La doppia marcatura del tubulo con anticorpi anti-GFP+ ed anti-citocheratine mostra che le cellule MSC-GFP+ localizzate nel tubulo esprimono i markers epiteliali . Inoltre l’analisi citofluorimetrica di cellule prelevate dal tubulo di topo iniettati con MSC-GFP+ 21 giorni dopo l’iniezione di glicerolo mostra che gruppi di cellule tubulari sono fluorescenti, quindi originato dalle MSC trapiantate.

4.3 ISOLAMENTO E CARATTERIZZAZIONE DI CELLULE PROGENITRICI RENALI.

le cellule CD133+dalla parte corticale renale adulta. Attraverso una selezione immuno-magnetica si sono isolate
La media delle cellule CD133 pescate, fluorescenti e attivate va da 0.8 a 0.2% delle cellule totali. Una prima caratterizzazione delle cellule isolate ha mostrato che virtualmente tutte le cellule estratte esprimono CD133, SH3, CD44 e CD29, che sono markers di membrana comunemente espressi nelle cellule mesenchimali staminali.

Inoltre tutte le cellule non esprimono CD34 e CD45, suggerendo che non derivano dalle cellule CD133 circolanti (fig.5c)

Per saperne di più sull’origine renale delle CD133 si è valutato l’espressione del marker renale dello sviluppo PAX-2 attraverso immunofluorescenza e un RT-PCR. Pax-2 è espresso nel mesenchima indotto e nei primi derivati epiteliali, mentre è rapidamente down-regolato nel rene maturo. Attraverso immunofluorescenza, si nota una tipica “macchia” nucleare per la proteina Pax-2. A differenza delle CD133 circolanti, quelle renali sono capaci di aderire alle piastre di fibronectina dopo un incubazione dalle 6 alle 8 ore: inoltre le cellule esprimono CD133 fino a sette/nove passaggi indicando che le cellule progenitrici renali adulte hanno un limitato autorinnovamento.

4.4 CLONAGGIO E DIFFERENZIAZIONE IN CELLULE EPITELIALI.

Si è analizzata la capacità di singole cellule CD133 di dar vita sia a popolazioni epiteliali che a popolazioni endoteliali, espandendo i cloni in medium e poi separandoli:  per ottenere differenziazione epiteliale, alcuni cloni sono cresciuti in presenza di EGF e FGF-4. Dopo 10 giorni in coltura, le cellule non esprimono più CD133, ma mantengono l’espressione di CD44. L’espressione delle citocheratine , che non si osserva quando le cellule sono indifferenziate, diventa del 50% dopo 5 giorni e del 100% dopo 10 giorni in coltura(fig.6C). Esprimono inoltre la vimentina, il marker mesenchimale, che è spesso co-espresso con la citocheratina nelle cellule tubulari embriologiche o indifferenziate

Per indurre la differenziazione endoteliale, le cellule sono piastrate con i fattori di attecchimento delle cellule endoteliale e cresciute in presenza di fattori di crescita endoteliali vascolari. Si osserva che l’espressione di CD133 è down-regolata dopo 3 passaggi (8giorni) e scompare dopo altri tre passaggi. Di contro, CD44 rimane indifferenziato(fig.6b) e dopo 3 giorni in coltura si iniziano ad esprimere i markers endoteliali Muc-18, KDR, CD105, VE-caderina e Vwf e l’epressione è massima al decimo giorno

4.5 IMPIANTO  In Vivo DELLE CELLULE PROGENITRICI RENALI

Le progenitrici renali CD133 sono state iniettate sottocute in Matrigel in topi SCID non immunocompetenti. Dopo 10 giorni le cellule indifferenziate mostrano una spontanea differenziazione in strutture epiteliali tubulari, hanno una aspetto morfologico polarizzato . La valutazione immuno-istochimica e la presenza di antigeni HLA di classe I indicano che queste strutture sono umane. Sono inoltre presenti  markers epiteliali e mesenchimali . Tuttavia in queste strutture sono anche presenti marker del tubulo distale ma non del tubulo prossimale.

Per valutare l’abilità dei progenitori renali CD133 di localizzarsi nel rene malato, si è indotto un danno tubulare iniettando intramuscolo del glicerolo in topi SCID (vedi paragr.2.4),  tre giorni dopo l’iniezione di glicerolo, sono stati iniettati 106 progenitori intravena, marcati con il colorante vitale PKH2 verde fluorescente e i topi sono stati sacrificati dopo altri 3 giorni.

Come mostrato in figura 8 A e C, cellule umane HLA di classe I si trovano nel tubulo distale e prossimale danneggiato. Quando i progenitori CD133 sono iniettati in un topo SCID non malato, si osserva una minima localizzazione dei progenitori nel rene

5.CONCLUSIONI

Le dimostrazioni che le cellule staminali mesenchimali contribuiscono alla rigenerazione del danno tubulare acuto sono molteplici: abbiamo visto come si posizionano nel tubulo danneggiato e come il tessuto presenta danni meno severi dopo la loro infusione.
Il meccanismo di rigenerazione delle cellule tubulari è ancora materia di dibattito: si ritiene attualmente che la  trans-differenziazione (termine con cui si indica la conversione fenotipica di cellule pluripotenti  in un tipo di tessuto piuttosto che in un altro, con genetica riprogrammazione se introdotte in un nuovo ambiente)o la fusione (meccanismo con cui le cellule staminali infuse si fondono con cellule differenziate residenti nel tessuto )  non possano di per sé giustificare l’estensiva rigenerazione dei tubuli danneggiati in quanto solo una minima porzione delle cellule che ripopolano i tubuli origina direttamente dalle cellule staminali inoculate. Si ritiene pertanto che l’effetto benefico della somministrazione delle cellule staminali sulla rigenerazione tubulare sia in gran parte da ascriversi ad un  meccanismo paracrino, che comporta  un’espansione delle cellule progenitrici renali residenti o una de-differenziazione di cellule tubulari mature sopravvissute al danno, inducendo una loro proliferazione e successivamente una differenziazione.
La potenzialità di questi progenitori renali di proliferare e di generare cellule con caratteristiche fenotipiche e funzionali delle cellule epiteliali tubulari potrebbe essere una risorsa per la riparazione renale, aprendo nuove prospettive terapeutiche sia somministrando ex vivo MSC, sia inducendo la proliferazione dei progenitori renali.

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