Valutazione della concentrazione di DNA attraverso metodo elettroforetico

-2° Giorno-
Valutazione della concentrazione di DNA attraverso metodo elettroforetico

Per valutare la concentrazione di DNA si può ricorrere, sopratutto nei casi in cui non si disponga di elevate quantità di DNA o in casi in cui siano presenti nucleotidi o oligonucleotidi, alla quantificazione diretta da gel d'agarosio su cui sia stato caricato oltre al campio a concentrazione ignota anche del DNA di riferimento presenti in quantità nota. La calutazione è approssimativa ma può essere più precisa se si eeffettua un'analisi elettroforetica densitometrica dell'intensità delle bande di DNA

Protocollo:
In questo esperimento procederemo a un trattamento del plasmide pGEM7Zf con un enzima di restrizione che lo lineariza. Il campione verrò sottoposto ad analisi elettroforetica e si procederà ad una stima approssima della quantità di DNA.

Si prepara la miscela di restrizione in due provette Eppendorf da 1.5ml sterili. Questa verrà preparate per aggiunta di DNA, tampone di digestione dell'enzima di restrizione XbaI e d'acqua per portare a volume finale di 10ul secondo lo schema seguente:

	DNA (ul)	Volume Tampone (10x)	H₂O	XbaI	Volume Finale
C	4	2 (tampone H)	14	-	20
X	4	2 (tampone H)	13	1	20

C= Controllo; X=Campione da valutare

Si mescolano le componenti e si centrifuga per pochi secondi in microcentrifuga da banco
Si incuba a 37°C per 1ora.
Alla fine dell'incubazione a 37°C, si dovrà aggiungere ad ogni campione 6ul di una soluzione 5 volte concentrata (5x) contenente blu di bromofenolo (indicatore del fronte di migrazione) e glicerolo (serve per appesantire il campione e facilitarne il caricamento nel pozzetto) [0.25% Blue di bromofenolo, 50% gliceronolo in H₂0].
I campioni vengono conservati a -20°C fino al giorno successivo.

Per separare frammenti di DNA viene utilizzata l'elettroforesi in gel d'agarosio.
Preparazione del gel (agarosio 0.8%)

Per ogni 0.4g di agarosio vengono sciolti 50ml di tampone TAE [0.04% M Tris-acetato, 0.001 M EDTA] in forno microonde per 2 minuti alla potenza di 350. La soluzione viene lasciata raffreddare a circa 60°C (risulta essere un calore sopportabile a contatto con la pelle) prima di essere versata nell'apposita vaschetta. Un pettine permette che si formino 12 pozzetti in cui caricare i campioni. Il gel viene lasciato polimerizzare per circa 20.30 minuti.

Elettroforesi e colorazione del gel

Ogni gruppo carica il campione della digestione, il controllo non digerito e 10ul di 1Kb-Dna Ladder per poter succesivamente effettuare una quantificazione del DNA caricato.
L'elettroforesi avviene a 80V (voltaggio costante) per circa 1.5-2 ore,a temperatura ambienete in tampone TAE(pH~7.4). A voltaggi elevati, la temperatura tende ad aumentare.
Il gel viene incubato per circa 15 minuti in acqua distillata contenente bromuro di etidio 0.5-1ug/ml. Il DNA viene evidenziato esponendo il gel colorato a luce ultravioletta (300nm). Il coorante4 legato al DNA emette luce fluorescente rendendo visibili i frammenti e il gel può essere fotografato.
Si stimerà la quantità di DNA e nel contempo si valuterà il suo grad di purezza e la sua integrità.

Note risultati e conclusioni:
L'elettroforesi viene effettuata su gel di Agarosio 0.8% che ha una capacità di separare frammenti dai 0.4Kb ai 50Kb, per frammenti più piccoli si usa un gel di poliacrilammide, per frammenti maggiori si usa la tecnica pulse filter elettroforesis.
I frammenti si separano per dimensione, essendo ricoperti di cariche (dati dai fosfati ionizzati) e disposti in un campo elettrico che li fa migrare attraverso le maglie del gel. Questo causa la formazione di bande contenenti DNA con stessa dimensione.
Per la colorazione dei campioni dopo corso elettroforetica, i gel vengono immersi in una soluzione contenente Etidio di bromuro, un intercalante che emette luce a 590 nm (giallo-arancio) sotto l'illuminazione con UV. L'intensità della luminosità delle bande è proporzionale alla quantità di DNA presente in quella banda
Viene usato, in questo esperimento, un ladder, marker, risolutivo sia per dimensione che per peso dei frammenti.
Come si può vedere dall'elettroforesi osserviamo nel plasmide non tagliato diverse forme di superavvolgimento. Poiché conosciamo la quantità di DNA nella banda del ladder vicino al tagliato (pari a 125ng), si può stimare che poiché la luminosità della banda del plasmide linearizzato è di circa tre volte maggiore del ladder, anche la quantità sarà circa tre volte più grande, pari a quindi, 375ng.