-7°/8° giorno-
Analisi di restrizione dei plasmidi ricombinanti
Analisi dei risultati dell'elettroforesi; definizioni
di alcune digestioni che si possono effettuare sui plasmidi ricombinanti;
allestimento digestione con opportuni enzimi su DNA plasmidico e
caricamento elettroforesi.
Protocollo:
- La miscela dir estrizione viene preparata per aggiunta di DNA,
tampone di digestione (fornito con concentrazione 10x), enzima
e acqua.
- Portare a volume finale di 10ul.
- Mescolare le componenti centrifugando per pochi secondi ed incubare
a 37°C per 1 ora.
Ogni enzima di restrizione opera a diverse condizioni ottimali
di forza ionica del tampone. Verranno forniti i tamponi (buffer)
opportuni per ogni enzima concentrati 10 volte e indicati con
le lettere H, B o M.
Allestire le seguenti reazioni:
| Schema digestioni |
| Notazione |
DNA
(ul) |
Volume
Tampone
(10x) |
H20
(ul) |
XbaI |
BamHI |
SphI |
HindII |
Volume
totale |
| X |
7 |
2 Tampone
H |
10 |
1 |
-- |
-- |
-- |
10 |
| B |
7 |
2 Tampone
B |
10 |
-- |
-- |
-- |
-- |
10 |
| S |
7 |
2 Tampone
M |
10 |
-- |
-- |
1 |
-- |
10 |
| Hi |
7 |
2 Tampone
M |
10 |
-- |
-- |
-- |
1 |
10 |
| Hi-B |
7 |
2 Tampone
M |
9 |
-- |
1 |
-- |
1 |
10 |
Per ogni enzima verranno utilizzate10 unità. 1 unità
i enzima dir estrizion è la quantità di enzima richiesta
per digerire 1ug di DNA lambda in 1 ora a 37°C in un volume
di 50ul.
Alla fine della digestione, l'elettroforesi viene
utilizzata per valutare la riuscita della stessa e permettere di
determinare la lunghezza dei frammentid i restrizione, mediante
confronto con la migrzione di standard di lunghezza nota (1Kb-DNA
Ladder).
Preparzione del gel(agarosio 1.2%):
- Per ogni gel 1.8g di agrosio vengono sciolti in 150 ml di tampone
TAE [0.04M Tris-Acetato,0.001 M EDTA) su piastra riscaldante.
- La soluzione viene lascita raffreddare a circa 60°C prima
di essere versata nell'apposita vaschetta.
- Un pettine permette che si formino 12 pozzetti in cui verranno
caricati i campioni.
- Il gel viene lasciato polimerizzare per circa 30 minuti.
Preparazione dei campioni per l'elettroforesi:
- Alla fine dell'incubazione a 37°C si dovrà aggiungere
3ul di una soluzione di blu di bromofenolo (indicatore del fronte
di migrazione) e glicerolo (serve per appesantire il campione
e facilitarne il caricamento nel pozzatto).
- I campioni vengono caricati nei pozzetti del gel. Vengono caricati
anche 10 ul di DNA Ladder. Dopo la corso vengono
visualizzati.
Esame delle foto del gel, allestimento curva calibraione
dl DNA ladder, determinazione delle dimensioni di frammenti, costruzione
della mappa dell'inserto.
Note, risultati e
conclusioni:
Nel settimo giorno osserviamo la corsa elettroforetica preparata
con i campioni ottenuti nell'esperienza precedente. Si può
osservare come siano presenti delle diverse isoforme del plasmide
nei primi due campioni, e come il plasmide senza inserto, nel terzo
pozzetto, sia corso di più , a testimonianza del suo peso
minore.
Gli enzimi scelti per effettuare la mappa di restrizione del plasmide,
non è ovviamente casuale.
Conoscendo la mappa del plasmide, vediamo come il sito XbaI, è
presente una volta sola, ed è stato usato anche per l'inserimento
dal plasmide. Da cui se ne deduce che nella corsa elettroforetica
che seguirà, otterremo due frammenti, uno grande quanto il
plasmide, uno quanto l'inserto.
Con il sito BamHI otteniamo un frammento solo, sito presente sul
plasmide, che ci indica la lunghezza del plasmide più l'inserto.
Con SphI si osservano due frammenti. Uno presente sul plasmide,
l'altro evidentemente sull'inserto.
HindII ci permette di osservare una banda unica, ma il suo sito
non è presente nel plasmide, deve quindi esserci un sito
di restrizione sull'inserto.
Il taglio effettuato con HindII e BamHI ci indica invece la distanza
presente tra i due siti di restrizione, essendo presenti entrambi
una volta sola sul plasmide, uno sull'inserto l'altro sulla porzione
del plasmide originale, rispettivamente.
Microbiologia
