Sequenziamento

-9°/10° giorno-
Sequenziamento

Lo scopo è l'allestimento di una reazione di sequanza secondo il metodo di Sanger con marcatura fluorescente. Completata la reazione si procederà alle prime fasi di una precipitazione alcolica, allo scopo di rimuovere i terminatori fluorescenti (dye terminator) non incorporati.
Sarà adoperato il kit "Thermo Sequenase Cy5.5 Dye Terminator Cycle Sequencing" che utilizza ddNTP marcati con il fluorocromo Cy5.5 (useremo un unico fluorocromo, quindi 4 eppendorf diverse).
I vantaggi del Cycle Sequencing sono le alte etmperature di polimeralizazzione che impediscono la formazione di struttureseconadrie; la scelta della etmperatura di annealing; maggior quantità di frammenti prodotti, con conseguente maggior facilità nella rivelazione delel bande.

Protocollo:

Marcare 4 provtte da 0.5ml con A,C,G,T per le rispettive reazioni di terminazione.
Pipettare 1ul della miscela da 1.5ml di terminazione Cy55 ddATP sul fondo della provetta marcata "A". Pipettare quindi 1ul di ciascuna delle destanti miscele di terminazione 5.5 ddNTP nelle corrispettive provette. Chiudere i tubi per prevenire l'evaporazione.

Preparare in una provetta da 1.5ml al segente miscela madre, secondo l'ordine riportato di seguito. Prima di aggiungere l'enzima Thermo Sequenase, mescolare il contenuto pipettando gentilmente. Centrifugare brevemente in microcentrifuga per far si che la miscela i depositi sul fondo della provetta. Aggiungere l'enzima, mescolare e centrifugare nuovamente per qualche secondo.

Componenti	Volume (ul)
Acqua distillata a volume	24
Dna stampo pGEM7Zf ricombinante (ng/ul)	1
Tampone di reazione	3.5
Primer universale pUC/M13 (2 pmoli/ul)	1


Thermo Sequenase Dna Polymerase (10U/ul)	2

Volume finale	31.5

Aliquotare 7ul della miscela madre in ciascuna delle quattro provette maracte, facendo attenzine a depositare la miscela stessa sul fondo della provetta, laddove presente il ul dela miscela di terminazione.
Mescolare ciascuna miscela di reazione e centrifugare brevemente (spin) se necessario. Evitare di lasciare volle di aria nella miscela di reazione

Porre le provetet nel termociclatore e iniziare il programma di amplificazione. Adoperarare il coperchio etrmostatato per evitare l'ecaporazione3 della miscela di reazione. I cicle di ampliicazione devono essere impostati come segue:

N°cicli	Temperatura	Tempo(min
1	95	2
30	95 58 72	0.75 0.75 1.5
1	72	5

A completamento del programma di amplificazione, centrifugare brevemente le provette per far depositare sul fondo eventuali condense. Quindi aggiungere a ciascuna delle 4 provette i seguenti componenti ed inverire 2-3 volte:

Componenti	Volume (ul)
Ammonio Acetato (7.5M)	2
Etanolo 100%	30

Mescolare e porre i tubi a -20°C per una notte.

Lo scopo della esercitazione è la preparazione di un gel di sequenza, il cariacmento delle reazioni di sequenza allestite nella precedente esercitazione, la corsa elettroforetica di sequenza e l'analisi dellìelettroferogramma.

Preparazione dei campioni:

Centrifugare le reazioni conservate in microcentrifuga a circa 1200 rpm per 30minuti a 4°C.
Eliminare il sovranatante, ed aggiungere 200ul di etanolo ferddo al 70%.
Ri-centrifugare come sopra per 10minuti.
Eliminare ogni traccia di Etanolo, ed asciugare il pellet sottovuoto per circa 3 minuti.
Aggiungere in ciascuna delle 4 provette 6ul di colorante "Formamide loading dye" (denaturante). Vortexare la provetta vigorosamente per 40sec per assicurare una completa risospensione del pellet.
Centrifugare brevemente per collezionare il campione sul fondo della provetta.
Denaturare a 75°C per 3 minuti (non a 95°C perchè si staccherebbero i fluorocromi) e riporli in ghiaccio.

Preparazione e caricamento del gel di sequenza

Il gel di sequenza è un gel denaturante (grazie all'aggiunta di urea, serve per evitare strutture secondarie dei filamenti ss) di acrilamide al 6% (l'acrilamide perchè vogliamo un gel di risoluzione). Verrà preparato utilizzando lastrine preassemblate di 14 x 14 cm, con un intercapedine di 50 um. La soluzione di acrilamide verrà inniettata nella intercapedine della lastra con una apposita pistola e la polimerizzazione avverrà in seguito alla esposizine della lastra a raggi UV per 3 minuti. Un gel di sequenza consente il caricamento di 16 campioni, cioè di 4 reazioni di sequenza, essendo ciascuna reazione di sequenza costituita dai campioni G, A, T e C.

Preparare 150 ml di soluzione tampone TBE 1X a partire da un soluzione madre di TBE 10X.
Posizionare la lastra di gel nell'unità elettroforetica verticale del sequenziatore automatico. Versare il tampone nelle due camere inferiore e superiore della unità elettroforetica. Procedere alla pulizia dei pozzettti di caricamento da eventuali residui di gel. Accendere il sequenziatore per far salire la temperatura del gel fino a 50°C.
Caricare 2ul di campione in ciascun pozzetto del gel di sequenza. Per ciascuna reazione (costituita dalle 4 provette marcate G, A, C, T) è necessario prendere nota dell'ordine di caricamento delle basi. Dopo aver caricat i 4 campioni di una reazione, si procede ad una breve corsa di 40 sec per consentire ai campioni di penetrare nel gel e di prevenirne quindi la diffusione. Completare il caricamento.
Procedere alla corsa elettroforetica per 45minuti (1500 Volt, temepratura 50°C)

Processamento dei dati Grezzi e controllo dell'elettroferogramma

I dati grezzi leti dal sequenziatore sono costituiti da 4 serie di picchi di fluorescenza parzialmente risolti, uno per ciascuna delle 4 basi. Ciascun picco corrisponde al segnale emesso da un frammento di DNA che termina con un ddNTP marcato con il fluorocromo. Un algoritmo di processamento del segnale separa i singoli picchi, procede allo shift delle 4 serie di picchi l'uno rispetto all'altro e attribuisce una base a ciascun picco. Si ottiene un elettroferogramma.