Preparazione cellule competenti

-3° Giorno-
Preparazione di cellule competenti con CaCl₂

Protocollo:

In cuvette di plastica monouso, si usa l'Assorbanza a 600nm di una pre-cultura OverNight (ON) contro un bianco costituito da terreno LB [Luria-Bertani broth, 1% peptone, 0.5% estratto lievito, 0.5% NaCl, 0.1% Glucosio].
Si calcola il volume di coltura da inoculare in una beuta contenente 50ml di terreno LB dalla formula che descrive la crescita esponenziale logaritmica. Sapendo che il T_d (Tempo duplicazione) è pari a 20 minuti, l'A₆₀₀ al momento della raccoltà dovrà essere di 0.4 e che le cellule verranno raccolte 1.5 ore dall'inoculo (t=90minuti), si risale all'A₆₀₀ iniziale. Questo valore andrà moltiplicato per il volume di terreno da inoculare.

A_t = A_t0 [2^(t/T_d)]
Ogni 20 minuti leggere l'A₆₀₀ per verificare la crescita.
Raggiunta l'assorbanza di 0.4 prelevare 8 ml d coltura e trasferire in una provetta sterile da 10 ml. Chiudere con l'apposito tappo per preservare le cellule da inquanamenti.
Si centrifugano i campioni a 4000 RPM in una centrifuga da banco per 10minuti
Si scara il surnatante versandolo in un recipiente vicino al Bunsen avendo cura di eliminare il terreno senza perturbare il pellet.
Aggiungere sterilmente 4 ml di una soluzione di cloruro di calcio [50mM CaCl2 in acqua] mantenuta in ghiaccio.Le cellule vanno risospese picchiettando con l'indice il fondo della provetta.
Lasciare le provette in ghiaccio per 20 minuti.
Centrifugare a 4000 RPM per 5 minuti.
Eliminare il surnatante.
Aggiungere sterilmente 600 ul di soluzione di CaCl2 fredda.
Rispospendere nuovamente le cellule. Controllare che la sospensione sia omogenea.
Conservare le provette in frigor in un recipiente contenente ghiaccio fino al momento della trasformazione.

Note, risultati e conclusioni:
Effettuiamo una serie di misure spettrofotometriche per determinare quando le cellule di E. coli sono in fase esponenziale, momento devono essere trattati con il cloruro di calcio.Come si può vedere dal grafico (su scala logaritmica) si ottiene una linea retta, a dimostrazione che siamo appunto nella fase esponenziale.

Il cloruro di calcio, agisce da chelante, in questo modo le cariche del DNA vengono schermate e possono entrare attraverso microfratture a livello di membrana a causa della sua cristallizzazione per la bassa temperatura a cui avviene il trattamento. E' da notare che normalmente il DNA entrato sarebbe aggredito da enzimi di restrizioni del batterio posti a difesa proprio da DNA esogeno. Tuttavia i batteri da noi usati, appartengono ad un ceppo geneticamente modificato, per evitare simili problematiche.