Estrazione plasmidica dai cloni ricombinanti

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Estrazione plasmidica dai cloni ricombinanti

Partendo dalle minicolture s'inizia l'estrazione di DNA plasmidico con il kiti Miniprep QIAGEN (si tengono delle frazioni intermedie).
Questo metodo si basa sul principio della cromatogragia a scambio anionico. Il DNA carico negativamente i lega a gruppi DEAE carichi positivament e fissati su una resina. La particola resina che useremo in questa purificazione (QIAGEN) permette di eluire mediante l'uso di tamponi a concentrazioni saline medie, molecole quali RNA, proteine, carboidrati e piccolimetboliti e a concentrazioni saline più alte viene eluito solo il DNA plasmidico.

Protocollo:

Centrifugare per 5 minuti a 4000rpm in centrifuga da banco
Eliminare il surnatente
Risospendere il pellet in 500ul d'H20 e trasferire la sospensione in una provetta Eppendorf d 1.5ml
Centrifugare per 2 minuti alla massima velocità in una microcentrifuga.
Eliminare il surnatante.
Aggiungere 250ul di tampone P1 [50mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM EDTA, 100 ug/ml RNasiA]
Risospendere le cellule.
Aggiungere 250 ul di tampone P2 [Tampone di lisi alcalina: 200mM NaOH,1%SDS(p/v)] e miscelare cpovolgendo per 3-4 volte la provetta (non usare vortex per evitare di frammentare il DNA cromosomale -circa 400Kb- e non superare i 5 minuti a questo stadio). Questo passaggio provoca la denaturazione di DNA e proteine e la solubilizazione delle membrane.
Aggiungere350ul di tampone N3 [Tampone di neutralizazzione: contenente potassio acetato, acido acetico,pH4.8], miscelare come al punto precedente. Questo passaggio contente la rinaturazione selettiva del solo DNA plasmidico, infatti quello cromosomle, si riassocia male, ingarbugliandosi.
Centrifugre alla massima velocita (13000rpm) in una microcentrifuga per 10 minuti. Il DNA plasmidico rimane in soluzione.
Aspirare il surnatante(colume di circa 950ul) e trasferirlo in una nuova provetta Eppendorf. Il sedimento contenente pareti, complessi di DNA cromosomale e proteine denaturate viene scartato.
Trasferire il contenuto della provetta su una microcolonna QIA-Prep.
Centrifugare per 1 minuto in microcentrifuga.
Eliminare il liquido che è filtrato attraverso la microcolonna.
Aggiungere alla microcolonna 0.75 ml di tampone PE [Tampone di lavaggio] e centrifugare per 1 minuto.
Scartare il liquido filtrato e centrifugare per un minuto per eliminare il liquido residuo.
Trasferire la microcolonna su una provetta Eppendorf da 1.5 ml.
Per eluire il DNA aggiungere al centro della microcolonna 50 ul di tampone EB [Tampone di eluizione: 10mM Tris-Hl, pH 8.5]
Lasciare assorbire per un minuto e poi centrifugare per 1 minuto.
Tenere l'eluato ed eliminare la microcolonna.
Allestire i campioni per l'elettroforesi, e farla partire.

Note, risultati e conclusioni:
Nei passaggi effettuati per l'estrazione plasmidica, possiamo osservare il significato dei vari passaggi.
Nel primo tampone usato del kit Miniprep QIAGEN, si osserva la presenza di RNasi che permette la digestione di tutti gli RNA presenti nelle cellule, siano transfert, messaggeri, o ribosomali.
Nella soluzione successiva per la presenza di NaOH abbiamo una denaturazione del DNA per il pH alcalino e la presenza di SDS che permette di distruggere le membrane.
L'ultimo tampone usato serve per far rinaturare il DNA, ma se quello plasmidica si associa in modo corretto, quello cromosomale, essendo di dimensioni maggiori, si ingarbuglia, potendo quindi distinguersi dal DNA plasmidica che rimane in soluzione.
La microcolonna QIA-Prep contiene un gel che è costituito da sferette inerti alle quali sono state legate delle sostanze (DAE) carico positivamente, il quale reagendo con le cariche negative dei plasmidi (dati dai fosfati), li trattengono.