Nel particolare la presente ricerca si occupa dell’osservazione e dell’analisi delle risposte biochimiche cellulari del Dicentrarchus labrax (branzino) allevato e selvatico, in base ai quantitativi di metalli pesanti quali il Rame, il Cadmio e lo Zinco da essi assorbiti.
Questa ricerca si va ad inserire in quel più ampio progetto strategico d’ateneo che ha preso il via da Dicembre 2007 nella Facoltà di Medicina Veterinaria di Ozzano Emilia, che ha come titolo DRAMET, un progetto che coinvolge più dipartimenti e ricercatori della Facoltà di Veterinaria e si occupa di studiare la doppia vita che riveste il Cu, cioè la sua essenzialità e la sua tossicità negli organismi acquatici.

La mia ricerca si costituirà inizialmente di analisi di laboratorio su esemplari di Folaga (Fulica atra) per comparare le due tecniche di mineralizzazione dei tessuti e vedere quali delle due dava i risultati migliori, poi ho effettuato una comparazione con gli standard europei (nel caso specifico ho utilizzato il BCR 183 R) .
Successivamente sono state effettuate analisi in D. labrax di allevamento forniti dal Laboratorio sperimentale di Acquacoltura di Cesenatico, esposti a concentrazioni note di Cu e in cui inoltre verranno dosati anche il Cd e lo Zn. I dati ottenuti nei branzini sono stati comparati con dati ottenuti da esemplari di orata allevata, per cercare di capire le eventuali differenze tra le specie.
Inoltre sono state dosate le quantità di Mt riscontrate nei tessuti esaminati, per avere la certezza dei risultati ottenuti con lo Spettrofotometro.

I microelementi si suddividono in essenziali (come Cu, Fe, Zn e molti altri) perché svolgono importanti funzioni biologiche, e in non essenziali (come il Cd, Hg e Pb), che non svolgono alcun ruolo biologico ma anzi sono altamente tossici.
Di questi elementi alcuni saranno oggetto particolare delle nostre ricerche (Rame e zinco), inoltre sarà preso in considerazione anche un metallo che non svolge alcun ruolo biologico ma è molto studiato per la sua tossicità, cioè il Cadmio.
In generale sono sostanze pericolose, che si sedimentano nel mare o in terra, possiedono alti tempi di estinzione (o Emivita) e sono molto persistenti nell’ambiente, si accumulano nella catena alimentare (bioaccumulazione) o nell’acqua (bioaccumulazione) e si depositano nei lipidi degli organismi biologici, .
La loro tossicità è dovuta al fatto che, pur essendo composti inorganici, quando vengono assorbiti e metabolizzati da organismi biologici si ha la sintesi di composti Metalloorganici, pericolosi perché solo con questa particolare struttura possono entrare nelle cellule ed interferire con il normale funzionamento biologico.
In piccolissime quantità alcuni metalli pesanti (rame, zinco e ferro, detti anche metalli essenziali) sono indispensabili per il normale funzionamento di alcuni enzimi in quanto formano dei complessi metallo-proteici definiti Metalloproteine.
Le metalloproteine svolgono determinate funzioni biologiche, tra le quali possono essere ricordate la funzione energetica (Fe e Cu sono presenti nei citocromi della catena respiratoria mitocondriale), quella di catalisi enzimatica (lo zinco è il maggior cofattore dei complessi metallo-enzimi), la funzione strutturale (le zincfinger o proteine a dito svolgono la loro funzione solo in presenza dello zinco), e quella di riserva e detossificazione (che regolano il metabolismo di alcuni elementi chimici e agiscono sull’omeostasi di diversi metalli pesanti tossici ed essenziali, tra cui di fondamentale importanza è la Metallotioneina).

Sono stati utilizzati esemplari di branzino allevato (Dicentrarchus labrax), forniti gentilmente dal Laboratorio sperimentale di Acquacoltura di Cesenatico, e di orata selvatica (Sparus aurata), provenienti da “Valle Cà Zuliani s.r.l.” (Porto Tolle, Rovigo), entrambe le specie del peso di 60 ± 5,8 gr, . Questi sono stati trasportati presso il Dipartimento di Clinica Veterinaria della Facoltà di veterinaria (Alma mater studiorum-Università di Bologna) dove è avvenuta la sperimentazione: i pesci sono stati suddivisi e disposti negli acquari di polietilene da 500 litri (10 esemplari per vasca), contenenti acqua di mare con salinità pari al 30‰. Gli acquari sono dotati di un impianto di riciclaggio dell’acqua mediante filtro biologico.
In data 3/12/07 parte dei branzini sono stati sacrificati e campionati (tempo 0) e con i restanti esemplari sono stati allestiti due gruppi, uno di controllo ed uno di animali esposti a 0,5 mg/l di Cu (aggiunto come CuSO4) per 14 giorni ad una temperatura di 9°C e campionati il 17/12/07. Gli esemplari di orata sono stati condizionati nelle stesse vasche di stabulazione con i medesimi parametri ed esposti il 28/01/08 a 0,5 mg Cu/l per 14 giorni alla medesima temperatura (T 9°C) e campionati il 11/02/08, Durante la stabulazione tutti i soggetti sono stati tenuti a digiuno. Per l’analisi della concentrazione dei metalli sono stati prelevati i seguenti tessuti: fegato, branchie, conservati fino al momento dell’analisi a – 20°C.

REAGENTI
*acqua ossigenata Selectipur 30% Merk Darmstadt, Germany
*acido nitrico Suprapur 65% Merk Darmstadt, Germany
*acqua bidistillata per analisi Merk Darmstadt, Germany
*standards per assorbimento atomico BHD Chemicals Ltd Poole, England

Per determinare la concentrazione dei metalli traccia cadmio, zinco e rame nei tessuti campionati ho ottenuto una completa mineralizzazione della matrice organica mediante un metodo di mineralizzazione a umido, ad alta pressione e temperatura, con aggiunta di acqua ossigenata e di acido nitrico in forno a microonde.
Piccole quantità di tessuto fresco (t. f.; da 250 a 500 mg) dopo scongelamento sono state pesate su bilancia analitica Mettler e mineralizzate con aggiunta di in 2 ml di HNO3 al 65% e 0,5 ml di H2O2 al 30% in forno a microonde modello 1200 della ditta Milestone, secondo un programma suggerito per campioni organici biologici (Tab. 1). Dopo raffreddamento dei contenitori le soluzioni acide sono state riprese con acqua bidistillata e portate a un volume finale di 10 ml (o 5 ml se il campione pesato inizialmente era poco) in provette tarate di polietilene. Per la mineralizzazione di campioni di peso particolarmente esiguo (50 mg t. f.) i tessuti pesati sono stati trattati con volumi di HNO3 e H2O2 concentrati (rapporto di 4:1 v/v) rapportati ai pesi del campione, a temperatura ambiente per 48 h e quindi opportunamente diluiti. Per evitare contaminazione le provette e i contenitori sono stati lavati con HCl 1N sotto cappa aspirante e sono stati indossati guanti durante tutta la procedura di estrazione. La concentrazione di metalli quali zinco, rame, cadmio è stata determinata mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico a ionizzazione di fiamma (spettrofotometro IL, U.S.A., modello 11), con atomizzazione del campione e lettura alle rispettive lunghezze d’onda di assorbimento dei metalli pesanti.

L’analisi della metallotioneina è stata condotta mediante tecniche biochimiche. Per la determinazione del suo contenuto nei tessuti mediante cromatografia a gelfiltrazione è stato utilizzato uno spettrofotometro ad assorbimento atomico a ionizzazione di fiamma per la lettura della concentrazione di metalli, quali cadmio e zinco nelle diverse frazioni. Nei seguenti paragrafi riporto la metodica di estrazione e determinazione della proteina nei tessuti analizzati. Durante l’estrazione della metallotioneina, dopo aver pesato esattamente il tessuto da analizzare (250-500 mg t. f.) ho provveduto ad applicare una quantità di tampone pari a tre volte il peso del campione fresco. In un secondo momento il campione è stato omogeneizzato per 30 sec. in ghiaccio con Ultraturrax a velocità di 13500 g/min. e centrifugato per 30 min. a 4°C a 35000 g (Optima LE-80K Ultracentrifuge, Beckman-Coulter). Il surnatante limpido è stato quantitativamente trasferito in una provetta e utilizzato per le diverse analisi. Le determinazioni sono state compiute mediante cromatografia per gelfiltrazione e analisi mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico (Carpenè e Vasak, 1989).
Il tampone utilizzato è costituito da Tris-HCl 20mM pH 8,6 5 mM β-mercaptoetanolo; un volume pari a - 1 ml (colonna da 1 m) di surnatante è stato caricato su una colonna da gel filtrazione.
Per l’analisi della metallotioneina è stata utilizzata la tecnica cromatografica di gel filtrazione che consiste nel separare le molecole per esclusione molecolare. E’ stata utilizzata una colonna di vetro con setto poroso sul fondo di 90 cm d’altezza circa e con un diametro interno di 1cm per l’analisi di campioni del peso iniziale di 200-500 mg. Come resina abbiamo usato una Sephadex G75, che permette di separare proteine con peso molecolare non superiore a 75000 d, precedentemente lasciata ad imbibire per 24 ore con un volume di tampone Tris HCl 20mM pH8,6 5mM β-mercaptoetanolo, pari a 15 ml/g di resina. Dopo aver eliminato le bolle d’aria con una pompa da vuoto, la resina è stata versata delicatamente lungo le pareti della colonna di vetro, precedentemente lavata con HCl 1 N e acqua bidistillata. Un’attenzione particolare và posta in questa fase, poichè è facile introdurre delle bolle d’aria nella resina; in tal caso il flusso del tampone attraverso la colonna risulterebbe irregolare e la separazione delle diverse molecole inefficace. La resina è stata lasciata sedimentare in colonna eluendo col tampone sopra menzionato per un volume pari circa a tre volte il volume della colonna con una pressione operativa via via più alta fino a circa 1m (la pressione operativa corrisponde alla differenza in cm tra il livello del tampone nel reservoir e il punto di uscita del tampone dalla colonna); il flusso è stato regolato a 30-40 ml/h. Al termine, si sono aggiunti 1-2 ml di una soluzione di resina Sephadex G-25; questa forma uno strato di 1-2 cm all’apice della colonna con funzione di filtro per preservare l’integrità del letto della G 75 all’atto del caricamento del campione, escludendo eventuali frustoli, grassi e altre impurità presenti nel surnatante caricato in colonna. La colonna cromatograficha è stata tarata con MT estratta e purificata da fegato di Carassius auratus (colonna 90 cm) (Carpenè e Vasak, 1989). In questo modo è stato possibile individuare le frazioni in cui eluiscono le metallotioneine.
Il tampone utilizzato come fase mobile è lo stesso utilizzato per la preparazione della colonna. Sono state raccolte frazioni di 1,45 ml di volume nelle colonne alte 1m; terminata l’analisi, la colonna è stata lavata con due volumi di tampone.

Le frazioni raccolte dopo cromatografia su colonna di gelfiltrazione sono stati analizzati allo spettrofotometro ad assorbimento atomico a fiamma per determinare la concentrazione di Zn, Cu, Cd.

Le concentrazioni dei metalli sono state analizzate mediante il test della varianza (ANOVA), i dati significativamente diversi (p<0,05) sono indicati con lo stesso numero.

La mineralizzazione è un passaggio fondamentale che precede la quantificazione, grazie all’utilizzo dello Spettrofotometro ad Assorbimento Atomico, dei metalli presenti nelle matrici organiche. In entrambe le metodiche sono stati utilizzati gli stessi reagenti, variando soltanto la temperatura e il tempo di digestione.
Nella mineralizzazione a umido con il forno a microonde, i campioni di tessuto sono stati mineralizzati perfettamente, senza la presenza di residui, che avrebbero potuto compromettere le analisi. Con questo metodo, è stato possibile quantificare anche il Cd. L’impiego del forno a microonde, permette quindi di ottenere la digestione dei tessuti esaminati e dati più accurati e precisi in breve tempo.
Nella mineralizzazione a temperatura ambiente abbiamo riscontrato alcune difficoltà relative alla mineralizzazione, quali la non completa mineralizzazione dei tessuti, soprattutto se ricchi di lipidi. Infatti in alcune provette contenenti tessuto di folaga ricco di lipidi e anche in una provetta contenente tessuto di branzino si è rilevata la presenza di gocce lipidiche in sospensione.
Concludendo, posso dire che la mineralizzazione a umido nel forno a microonde è la metodica che riesce a dare i migliori risultati in breve tempo (2-3 ore), anche se richiede una discreta manualità ed attenzione, mentre la mineralizzazione a temperatura ambiente non sempre riesce a fornire campioni analizzabili e i dati ottenuti possono essere poco precisi, oltre a richiedere un tempo di attesa maggiore.

Branchie e fegato sono i tessuti che maggiormente risentono di un’esposizione a Cu in acqua, presentando un significativo accumulo dose-dipendente.
Le branchie sono rivestite da un epitelio che svolge un ruolo fondamentale nell’assorbimento del metallo e al contempo rappresenta un primo sistema di difesa in caso di esposizione a Cu in acqua grazie al muco esterno presente, che può legare il Cu a causa dell’alta affinità per i metalli dei proteoglicani e delle glicoproteine che lo compongono (Lock. R., 1995).
Il fegato, invece, è un organo fisiologicamente deputato al metabolismo ed all’accumulo del Cu. I valori elevati di Cu riscontrati nel fegato degli esemplari di branzino potrebbero essere indicativi di diete ad elevato contenuto di Cu, o alla presenza di Cu nell’acqua a causa di trattamenti con fitofarmaci o vernici “antifouling” .
Inoltre, il mancato accumulo di Cu nel fegato dei pesci esposti al metallo potrebbe essere collegato ai sofisticati meccanismi responsabili dell’omeostasi del Cu.
A tal riguardo, ricordiamo che il rame è un metallo traccia normalmente presente nella crosta terrestre, sciolto nell'acqua e a livello dei sedimenti. Le sue concentrazioni nell'ambiente acquatico sono in continuo aumento a causa di scarichi industriali, agricoli e urbani, rendendo questo metallo una possibile fonte di rischio per gli animali acquatici. Nelle acque costiere dell'alto Adriatico una ulteriore fonte di rame può essere rappresentata anche dagli allevamenti intensivi di branzini e orate che utilizzano mangimi arricchiti con questo metallo.
Da studi condotti su lieviti e mammiferi è noto che le proprietà redox del Cu sono fisiologicamente utilizzate da molte metalloproteine, di conseguenza, le concentrazioni del metallo sono sempre strettamente controllate da specifiche proteine quali la metallotioneina (MT), le chapperonine e alcune ATPasi specifiche di tipo P.
Per quanto riguarda il Cd, sia nei soggetti esposti che nei controlli al T0 e al T1 non sono state osservate variazioni significative; le concentrazioni riscontrate a livello epatico sono forse dovute ad una limitata presenza del metallo nell’ambiente naturale da cui sono stati prelevati i pesci.
Per quanto riguarda lo Zn, si è riscontrata una maggiore concentrazione negli esemplari al T0. Le concentrazioni di Zn fisiologicamente più elevate rispetto al Cu sono correlabili alla maggiore quantità di enzimi e proteine zinco-dipendenti e quindi alla necessità di una maggiore biodisponibilità di questo metallo. Lo Zn è un metallo traccia essenziale con fondamentali funzioni biochimiche collegate al mantenimento delle strutture delle membrane (Bettger and O’Dell, 1981), all’attività di svariati enzimi quali la RNA-polimerasi, l’anidrasi carbonica, la CuZn-SOD, nonché di numerose proteine zinc-fingers. In seguito ad esposizione al Cu si ha una diminuzione della concentrazione epatica di Zn nei soggetti esposti. Probabilmente la variazione del metallo è dovuta a induzione della sintesi di MT, che facilita la mobilizzazione dello Zn disponibile come dimostrato nelle orate (Isani et al., 2003). Nelle branchie le concentrazioni di Cu e Zn hanno dimostrato un incremento significativo (p<0,05) negli esemplari esposti a Cu, mentre il Cd non ha fatto registrare variazioni apprezzabili, ma come per il fegato, le concentrazioni degli esemplari al T0 sono elevate.

I risultati ottenuti mostrano che l’elevato aumento della concentrazione epatica e branchiale di Cu nell’esemplare esposto al metallo potrebbe essere correlata all’induzione della sintesi della Mt. Tale ipotesi è supportata da un precedente esperimento che dimostrato la biosintesi di CuMT in risposta all’esposizione a Cu nell’orata, dove si può notare chiaramente il picco della CuMt.
Le elevate concentrazioni epatiche di Zn negli esemplari esposti sono dovute al fatto che il metallo, come precedentemente riportato, è fondamentale per il funzionamento dei meccanismi anti-ossidanti, e dove si riscontrano alte concentrazioni di radicali liberi si riscontrano anche elevati livelli di proteine contenenti Zn..
Se mettiamo a confronto i dati ottenuti nel branzino con quelli ottenuti nell’orata, possiamo notare la grande differenza di concentrazione di Cu nel fegato dei branzino, con valori circa 20 volte maggiori rispetto a quanto riscontrato nell’orata. In teoria la grande differenza nei livelli epatici del Cu si potrebbe spiegare come conseguenza sia di un diverso habitat all’interno di Valle Cà Zuliani, che come una diversità genomica tra le due specie. Infatti, a supporto di quest’ultima tesi, confrontando i dati degli esemplari di branzino e orata esposti alla stessa concentrazione di Cu si può notare come nell’orata (anche se ci riferiamo ad un unico esemplare) ci sia un maggiore accumulo. Per avere delle conferme definitive però si necessita di studi più approfonditi, questa vuole essere solo una ipotesi per sviluppare future ricerche.

ivan cantani