Abbiamo già discusso alcuni dettagli relativi ai plasmidi. Essi hanno proprietà molto utili per il clonaggio. Queste proprietà includono:
(1) dimensioni ridotte che facilitano l'isolamento e la manipolazione del DNA;
(2) forma circolare che rende il DNA più stabile durante l'isolamento;
(3) origine di replicazione indipendente, in modo tale che la replicazione del plasmide nella cellula proceda indipendentemente dal controllo diretto del cromosoma;
(4) elevato numero di copie nella cellula che rende possibile l'amplificazione del DNA;
(5) presenza di marcatori selezionabili, quali la resistenza ad antibiotici, che semplificano l'identificazione e l'isolamento dei cloni contenenti plasmidi.

Sebbene in condizioni naturali i plasmidi coniugativi siano generalmente trasferiti attraverso il contatto tra le cellule, i vettori di clonaggio vengono spesso modificati, per ragioni di sicurezza, per prevenire il loro trasferimento mediante coniugazione. Infatti, in laboratorio, l'introduzione di un vettore in un ospite può essere effettuato mediante trasformazione.
A seconda del sistema ospite‑plasmide, la replicazione del plasmide può avvenire sotto stretto controllo cellulare, nel qual caso le copie prodotte sono poche, oppure con un controllo cellulare più blando e la produzione di un numero elevato di copie. Spesso in un clonaggio genico è importante avere un alto numero di copie; attraverso un`appropriata scelta del sistema ospite‑plasmide e l'alterazione della sintesi delle macromolecole cellulari è possibile ottenere diverse migliaia di plasmidi per cellula.

Il plasmide pBR322 è un esempio di un vettore di clonaggio molto usato, in grado di replicarsi In Escherichia coli. Il plasmide pBR322 ha diverse caratteristiche che lo rendono utile come vettore di clonaggio:

I. E` relativamente piccolo, solo 4361 paia di basi.

2. Si mantiene stabilmente nel suo ospite (Escherichia coli) ad un numero relativamente alto di copie per cellula (20‑30).

3. Può essere amplificato fino ad un numero elevato (1000‑3000 copie per cellula, circa il 40% del genoma!) mediante l'aggiunta di cloramfenicolo, che inibisce la sintesi proteica.

4. E` facile da isolare in forma superavvolta mediante diverse tecniche semplici .

5. E` possibile l'inserimento di una discreta quantità di DNA, nonostante che inserti superiori alle 10 chilobasi portino alla instabilità plasmidica.

6. Essendo nota l'intera sequenza delle basi di questo plasmide, è possibile localizzare i siti riconosciuti da enzimi di restrizione.

7. Sono presenti siti unici per diversi enzimi di restrizione come PstI, SalI, EcoRI, HindIII, BamHI e molti altri. Il sito EcoRI è localizzato tra i geni che codificano per la resistenza agli antibiotici presenti sul plasmide. È importante la presenza di un sito unico per almeno un enzima di restrizione, in modo tale che il trattamento con quell'enzima linearizzi il plasmide, senza frammentarlo.

8. Sono presenti due marcatori di resistenza agli antibiotici, ampicillina e tetraciclina che permettono una facile selezione delle cellule ospiti contenenti il plasmide.

9. Può essere facilmente introdotto nelle cellule mediante la trasformazione. Come abbiamo visto, il sito BamHI è all'interno del gene per la resistenza alla tetraciclina e il sito PstI in quello per la resistenza all'ampicillina. Se un frammento di DNA esogeno viene inserito in uno di questi siti, la resistenza all'antibiotico conferita dal gene localizzato in quel punto viene persa con un fenomeno detto inattivazione inserzionale. Questa inattivazione è utilizzata per identificare la presenza di DNA esogeno nel plasmide. Quindi, se pBR322 viene digerito con BamHI, legato al DNA da inserire e successivamente vengono isolati i cloni batterici trasformati, i cloni selezionati che risultano resistenti sia all'ampicillina che alla tetraciclina sono quelli che non hanno inserito il DNA esogeno (il plasmide incorporato nella cellula è il vettore che si è richiuso senza introduzione di DNA esogeno). Al contrario, quelle cellule che sono ancora resistenti all'ampicillina, ma sensibili alla tetraciclina, contengono il plasmide nel quale si è inserito DNA esogeno. Poiché la resistenza a questi due antibiotici può essere valutata su piastre di terreno agarizzato, è possibile individuare facilmente i batteri contenenti il clone desiderato ed eliminare le cellule che non contengono il plasmide.

I primi vettori di clonaggio utilizzati sono stati i plasmidi presenti in natura. Il plasmide pBR322 rappresenta una generazione più recente di vettori di clonaggio, costruiti in vitro. Il gene per la resistenza alla tetraciclina in pBR322 deriva da un plasmide, l'origine di replicazione da un altro e il gene per la resistenza all'ampicillina dal trasposone Tn3. Sono ora disponibili nuove generazioni di vettori plasmidici costruiti con caratteristiche utili e di facile impiego. Queste nuove caratteristiche includono quasi sempre un "polylinker" (o sito di clonaggio multiplo), un breve segmento di DNA con molti siti di restrizione unici. Questo "polylinker" è generalmente contenuto nella regione codificante di un gene la cui inattivazione inserzionale può essere facilmente identificata. Queste caratteristiche si ritrovano anche nei vettori fagici.

Il clonaggio in un plasmide come pBR322 è una procedura versatile e abbastanza generale, di uso diffuso in ingegneria genetica, in particolare quando il frammento che deve essere clonato è abbastanza piccolo. I plasmidi sono i vettori migliori quando si desidera l'espressione del gene che si è clonato. Federico Cesareo

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